外周血树突状细胞(DCS)疫苗治疗妇科恶性肿瘤的临床及实验研究

姚 勤

(太康县康复医院,河南太康461400)

1 材料来源

1.1 临床资料

2009年8月—2010年6月,对在我院住院治疗的15例患者进行DCS疫苗治疗。其中卵巢恶性肿瘤10例(转移癌2例)、子宫颈癌5例,均为Ⅱ期以后病例,年龄36～65岁,平均年龄46.8岁。

1.2 主要试剂

rhGM-CSF、白介素4(IL-4)购自深圳晶美生物工程公司,淋巴细胞分离液购自天津中科院血液病研究所,RPMIl640培养基购自美国GIBCO公司,新生牛血清自制。

1.3 肿瘤细胞株

Hela细胞、卵巢癌细胞株3AO:本实验室培养传代。

2 实验方法

2.1 树突状细胞(DCS)疫苗治疗技术路线

①手术中取肿瘤组织送实验室,一部分体外培养肿瘤细胞,另一部制备肿瘤可溶性抗原;②取患者的外周全血10～15mL(肝素防凝)送实验室,分离DCS,制备疫苗;③一周后,将制备好的疫苗取回,给病人作皮下注射,同时送第2次用防凝血,分离DCS制备疫苗;④一周后,取回第2次用DCS疫苗,皮下注射,同时送第 3次用防凝血,分离 DCS制备疫苗;⑤一周后,取回第3次用DCS疫苗,皮下注射。待病人一月后复查时,抽取防凝血做免疫学检测。

2.2 树突状细胞(DCS)疫苗的制备方法

(1)自身可溶性肿瘤抗原的制备:手术中无菌获取患者的肿瘤组织,并尽可能避免非肿瘤组织,立即送实验室,取适量加RPMIl640培养液,低渗反复冻溶3次,过滤除菌,即为无菌可溶性全抗原。

(2)树突状细胞(DCS)的分离:取患者的外周全血10～15mL(肝素防凝),生理盐水对倍稀释,缓缓加入盛有等量淋巴细胞分离液的离心管中,3 000～4 000r/min离心25min,用平头吸管吸取界面灰黄层细胞,即白细胞层。加人生理盐水混匀,5 000r/min离心10min,弃上清,取沉淀,再加生理盐水混匀,2 000r/min离心10min,洗3次,以含10%患者自身血清的RPMIl640培养液悬浮细胞,置培养瓶中,37℃、5%CO2培养2h,轻轻反过培养瓶,将上清液中非贴壁细胞倒入另一培养瓶中,即得贴壁的单核细胞,补加10%FCS1640,同时加入hGM-CSF200ng/mL,IL-4 600U/mL,置37℃度、5%CO2培养。非贴壁细胞同时培养,但不必加入各种细胞因子。贴壁细胞继续培养至第3～4天,在细胞因子作用下,即变为悬浮的,具有突起的未成熟的DCS。

(3)DCS疫苗的制备:未成熟的DCS具有摄取、加工抗原的能力,加入可溶性肿瘤抗原,继续培养至第7天,即得到递呈抗原能力的成熟树突状细胞疫苗。

(4)疫苗的回输离心收集DCS疫苗,用生理盐水反复洗涤4次,最后溶于1mL生理盐水中,细胞含量约为(1～2)×106,皮下接种给患者。

2.3 免疫学检测

2.3.1 体外细胞毒T淋巴细胞(CTL)水平检测

①从制备DCS时留下的上清液中常规分离T细胞;②CTL的制备:于多空板中加入T淋巴细胞(1×105,作为反应细胞)、DCS疫苗(5×103,作为刺激细胞)在IL-2(100U/mL)存在的条件下,37℃、5%CO2培养5天,收集 T细胞(即特异性抗原激活的CTL),以RPMIl640培养液稀释备用;③肿瘤细胞的原代培养:将手术切除的瘤组织无菌剪碎至1mm3,加0.2%胰酶消化30min,离心,弃上清,沉淀以含15%新生牛血清的1 640培养液悬浮吹打,室温沉淀5min,取上清液,显微镜下细胞计数器计数,调整细胞浓度至1×105,接种于细胞培养瓶,5%CO2、37℃静止培养,7天后长成单层,以2%胰酶消化传代备用。

2.3.2 细胞毒实验结果

细胞毒实验结果,见表1。

表1 DCS激活的CTL对患者自身肿瘤细胞,HeLa细胞,卵巢癌细胞株3AO的杀伤力

表2显示DCS疫苗诱导的CTL对患者自身肿瘤细胞具有明显的杀伤力,但对HeLa细胞,卵巢癌细胞株3AO仅有微弱的杀伤力,DCS及未激活T细胞对患者自身肿瘤细胞无杀伤作用。

细胞毒实验:以DCS激活的CTL作为效应-细胞,患者自身肿瘤细胞、Hela细胞、卵巢癌细胞株3AO作为靶细胞,效靶比为50∶1进行细胞毒实验。同时以DCS及未激活T细胞作为效应细胞,患者自身肿瘤细胞作为靶细胞,效靶比为50∶1进行细胞毒实验。用MTI法检测效应细胞对靶细胞的杀伤活性。

2.3.3 T细胞亚群变化

分别于DCS疫苗治疗前、治疗后(一般在第 3次注射后),取肝素防凝的静脉血2mL,送流式细胞仪室检测T细胞亚群。

3 结果

疫苗治疗后肿瘤控制情况:10例卵巢恶性肿瘤患者,术后、疫苗治疗后均接受常规化疗,其中4例复发(1例因减瘤不理想已死亡),5例子宫颈癌患者,1例复发,但均存活。疫苗治疗前、后T细胞亚群的变化,见表2。

从表2可以看出,患者经树突状细胞疫苗治疗后,T细胞亚群发生明显变化,CD+4T、CD+8T明显增加,CD+4/CD+8比例恢复(P＜0.01)。

表2 治疗前后T细胞亚群变化(s)

表2 治疗前后T细胞亚群变化(s)

分类/项目 CD+3T CD+4T CD+8T CD+4/CD+8治疗前 45.51±4.54 24.13±4.2321.89±1.641.08±0.26±治疗后 65.05±5.30 42.46±4.47 27.2±1.96 1.60±0.16正常组 59.58±9.94 39.32±6.8424.88±4.98 1.40±0.28

4 讨论

DCS作为目前普遍公认的抗原递呈细胞早就被人们所重视,由于孕妇外周血中该细胞的含量极少,仅占单核细胞总数的0.1%～1.0%,且提取物的分离纯化困难,在临床生化上应用不多。近年来,IL-4和GM-CSF等细胞因子联合应用,使体外DCS的扩增条件优化,为其功能及分化状态的进一步深入得以基本实现,为卵巢恶性肿瘤的早期发现奠定了基础。为获得足够量的DCS供临床应用,多数实验室都通过分离CD+4的造血干细胞,并联合应用多种细胞少因子的培养体系,获得功能性DCS,本试验利用外周血分离DC单核细胞,并选用GM-CSF、IL-4体外诱导DCS,从而获得了良好的效果。

负载肿瘤抗原的DCS作为载体后,可以激发机体有效的抗肿瘤免疫应答,本试验成功地诱导了具有肿瘤特异性的CTL,与自身肿瘤细胞共同培养后显示出明显的抗肿瘤效应。充分证明了这一点。从治疗后T细胞亚群的变化上,可以体现DCS在改善机体抗肿瘤免疫应答中的作用,当然,不能排除手术切除肿瘤或减瘤术后,由于肿瘤负荷减轻,机体的免疫功能本身就得到改善。由于病例数少,哪一种治疗方法起主导作用,还需进一步观察,而且,10例接受DCS治疗的卵巢癌患者,其复发率也未见明显降低,所以完善DCS疫苗治疗方面,还有大量工作要做。

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