活骨注射液髋关节腔注射对兔VEGF mRNA表达影响的研究

徐西林，张晓峰，段洪超，孙辉，高鹏

(1.黑龙江中医大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001;2黑龙江中医大学，黑龙江哈尔滨150040)

股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是由于各种病因使股骨头的血液供应受到了破坏所造成的最终结果，一般认为不经任何治疗，可致使股骨头承重部分塌陷，最后形成髋关节严重的功能障碍，是常见的致残疾病之一。在疾病早中期重建股骨头血运，促进坏死区的修复，防止股骨头的塌陷，已成为ONFH治疗的趋势，本文通过活骨注射液关节腔注射对液氮冷冻法兔ONFH VEGF表达影响的实验研究，探讨中医治疗ONFH的新方法，取得了良好的疗效，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制作 选用适龄新西兰大白兔30只，体质量2.2～2.5kg，雌雄各半，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。用液氮冷冻法制造家兔模型，术后每天2次肌注青霉素20万单位，预防感染，每天诱导动物爬坡喂食，在兔后肢负重状态下驱赶动物3次。

1.2 动物分组与给药方式 随机分为模型组，给予生理盐水髋关节腔注射治疗;治疗组，给予活骨注射液髋关节腔注射治疗。造模后1周后处死动物6只，经病理切片检查证实造模成功后开始给药。于1周及9周分批处死模型兔。

1.3 给药剂量 活骨注射液髋关节腔内注射剂量计算(现无国家规定的关节腔内注射剂量换算公式，参照目前的动物实验给药方法、剂量、换算方法，采用自定关节腔内注射剂量计算公式):动物与人等效剂量的换算公式，即:实验动给药剂量(ml/kg)=人的给药剂量(ml/kg)×(实验动物平均体重/人的平均体重)，得出每只模兔的给药总剂量≈0.005 8ml/kg;同理得出对照组每只模兔的给药总剂量≈0.005 8mg/kg。

1.4 检测指标及检测方法 采用RT－PCR法检测VEGF mRNA表达情况。

2 方法与结果

2.1 RT－PCR 总RNA提取及逆转录:取100mg碎裂股骨头组织加入1ml Trizol(美国Invitrogen公司)，提取总RNA，按照试剂盒说明在20μl体系下完成逆转录。PCR引物序列:见表1。逆转录(RT)反应体系为 20μl，42℃、60min→95℃、5min→4℃、5min。PCR反应体系为 50μl，按照:预变性，95℃、5min;变性，94℃、30s;退火 30s;延伸，72℃、30s;重复变性、退火、延伸，共35个循环，充分延伸，72℃、7min，结束温度为4℃。扩增产物分析:取5μl产物在80V电压下经2%琼脂糖凝胶电泳50min，利用凝胶成像系统分析、扫描、拍照，获取条带平均密度和面积数据计算VEGF、β－actin的mRNA相对含量。GSR计算方法为:测得的目的基因的平均密度×面积/β－actin的平均密度×面积。

2.2 治疗后VEGF表达情况的对比 结果见图1。

表1 引物序列(使用Primer Premier 5.0软件设计)

图1 β－actin、VEGF表达

运用析因分析表明，治疗组活骨注射液对ONFH治疗过程中VEGFmRNA的表达有影响(P＜0.01)，具有统计学意义;治疗时间对ONFH治疗过程中VEGF mRNA的表达有影响(P＜0.05)，具有统计学意义。

3 讨论

ONFH的基本病理特征是骨缺血导致的骨坏死。股骨头坏死后再生血管穿透能力只有10～15mm，因此常遗留软骨下骨坏死不能修复，此处易发生微骨折并逐渐形成硬化骨，又进一步挡住了新生血管进入，使坏死的自然修复更为困难。由于股骨头自然修复过程缓慢，且坏死区只有部分能被修复，所以通过各种治疗方法促进血管的再生进而促进骨组织的再生才有可能达到治疗作用。在目前已知众多具有促进血管再生功能的细胞因子中，VEGF是最强有力的一种血管生成因子，它通过与血管内皮上的特异性受体结合，具有强大的促进血管生成的作用，而其他的促血管再生的细胞因子则是全部或者部分通过增强VEGF的表达来完成其作用的。研究表明:成熟的、已经存在的血管对VEGF的依赖性不强;而新形成的血管的内皮细胞则对VEGF具有强烈的依赖性，这种原因主要是由于外皮细胞的覆盖所导致。

我们认为，在股骨头缺血性坏死发病过程中，“血瘀”始终贯穿本病，即股骨头缺血性坏死主要是以“血瘀”为主导或表现的病理过程。活血化瘀在治疗本病的过程中有着重要的作用和功能，而活血化瘀中药在治疗股骨头缺血坏死的过程中必定有其相应的作用对象，从而使坏死的骨组织修复。现代研究认为，血管再生的过程适用于中医学“生脉”的范畴，包括保持血管内血流通畅，瘀阻、闭塞的血管出现再通，新的血管生成。因此，在股骨头缺血性坏死发病过程中，骨坏死是由于瘀血阻滞引起，而新骨的再生必须在“生脉”的基础上，瘀去则新生。然而活血化瘀中药在这其中是通过何种机制产生作用的，这是现代医学研究的热点问题，对此进行研究，将有助于了解中药治疗ONFH的作用机理，探讨中医对本病治疗的新方法。

活骨注射液是在对ONFH的发病机理认识的基础上，依据“活血化瘀”的传统中医理论，从文献中筛选具有代表性的、疗效明确的且根据临床经验，结合现代药理研究成果，选取了以丹参等中药制成的复合水针制剂。活骨注射液髋关节腔注射治疗突破了传统治疗ONFH的中药的剂型和给药方式，既保留了中药标本兼治的优势，又发挥了局部给药的优势。以往临床治疗表明:活骨注射液髋关节腔内注射治疗可在短时间内有效的改善ONFH的临床症状，促进坏死骨的再生。本实验研究结果表明，活骨注射液在ONFH治疗1周后就可以促进VEGF表达上调，作用时间可以持续到9周以上。可见:活骨注射液髋关节腔注射治疗ONFH过程中，可以在长时间内促进VEGF的高表达及血管再生，从而达到坏死骨修复的目的;活骨注射液髋关节腔注射治疗ONFH疾病过程中，VEGF表达的持续时间及表达量要优于ONFH自然修复过程，并有可能伴随着坏死骨修复的全过程。