养心颗粒对p53基因转染易损斑块家兔模型血浆巨噬细胞游走抑制因子(MIF)影响的研究

王玉平，刘影哲，周亚滨，孙静，于晓红，杨建飞

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

动脉粥样硬化是以脂质与纤维成分在大动脉壁沉积为特征的慢性进行性病变，目前对动脉粥样硬化的发病机制尚未完全明了，但普遍认为，动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，而MIF是重要的促炎性细胞因子中的一种。养心颗粒用于临床治疗动脉粥样硬化(AS)已取得肯定疗效［1］。养心颗粒是以明代王肯堂所著《证治准绳》中养心汤为基础研制而成，原方以益气养心安神为法，由黄芪、人参、茯苓、当归等13味中药配伍而成。本实验通过对易损斑块家兔模型MIF含量水平的测定，探讨中药养心颗粒对稳定斑块的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性家兔24只，体质量2.3～2.6kg，4～5月龄，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号:SCXK(HEI)2007003，均在通风，温度、湿度适宜的动物室内单笼常规饲养。

1.2 药物及试剂 养心颗粒由黑龙江中医药大学制剂室制备成养心颗粒粉末，每克粉末含7g生药，将中药粉末加蒸馏水定期配制成混悬液，浓度为40%;辛伐他汀片(浙江京新药业股份有限公司，批号0908221);中国斑点蝰蛇毒(广州蛇毒研究所);组胺(上海卓康生物科技有限公司，批号 100102);重组p53腺病毒注射液(深圳市赛百诺基因技术有限公司生产，国药准字S20040004);MIF试剂盒(美国R＆D生物技术公司)。

1.3 仪器 手推式压力器(爱尔兰MERITMEDI公司);CR21型低温高速离心机(日本日立公司);2.5mm×15mm PTCA球囊(日本TERU－MO公司);5F导管(日本TERUMO公司);穿刺针(日本TERUMO公司);SONOS7500型彩色多普勒超声心动图仪(荷兰飞利浦公司);MDF－U50V超低温冰箱(日本日立公司);7170型全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.4 造模分组 1)球囊损伤颈总动脉内膜［2］:术前禁食12h给予20%的乌拉坦(1.0g/kg)经家兔耳静脉麻醉，将颈部剪毛，碘伏酒精常规消毒，沿颈部正中切开皮肤，暴露左侧颈总动脉及颈内外动脉的分叉，分离出左侧颈外动脉结扎远心端，“V”剪开颈外动脉，自颈外动脉向近心端插2.5mm×15mm球囊至颈总动脉起始部，尾部连接手推式压力泵，球囊内注入生理盐水，膨胀球囊后维持6个大气压持续约30s，自近心端缓慢拉回，反复3次退出球囊。于剪开处近端结扎颈外动脉，局部喷洒庆大霉素，逐层缝合皮下组织及皮肤。术后连续3天肌肉注射青霉素。2)高脂饮食喂养:颈总动脉球囊损伤的家兔以高脂饲料(20%蛋黄粉、80%基础饲料、外加1%胆固醇)喂养8周，经彩色多普勒超声检测证实颈总动脉粥样斑块形成。3)p53基因转染［2－3］:麻醉动物，暴露左侧颈总动脉，以左颈外动脉根部至其近心段4.0cm之间血管段作为转染部位，夹闭其两端，向该部位管腔中注入50μL重组人p53腺病毒注射液，10 min后恢复血供，关闭切口。术后常规预防感染3天。并于处死动物前24～48h给予两次药物触发，斑点蝰蛇毒0.15mg/kg腹腔下注射，耳缘静脉注射组胺0.02mg/kg。将造模成功后家兔随机分为模型对照组，养心颗粒组，辛伐他汀组，每组6只，另取6只为空白对照组。按人兔给药剂量体表面积折算公式计算出给药计量，各治疗组给予药物灌胃2周，养心颗粒组按0.643g/kg/d粉末给药;辛伐他汀组按2.5mg/kg/d给药，空白组及模型组灌服同体积蒸馏水。

1.5 标本采集与处理 分别于实验前及实验第8周末、10周末，用一次性5ml注射器快速而动脉取血3ml注入试管中以3500转/min离心15min，取血清，放入冰箱冷冻保存。按试剂盒说明方法测定血浆巨噬细胞游走抑制因子(MIF)含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS 17.0 for Windows统计软件进行统计分析。所有数据采用(±s)表示，组间均数的比较采用单因素方差分析及配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组与空白对照组相比，各组在8周末MIF的含量升高(P＜0.01);10周末与本组8周末比较MIF含量降低(P＜0.01);10周末养心颗粒组与辛伐他汀组比较MIF含量降低(P＜0.01)。

表1 家兔MIF浓度变化的比较(±s，ng/mL)

表1 家兔MIF浓度变化的比较(±s，ng/mL)

注:8周末各组与空白对照组比较，☆P＜0.01;与8周末比较，▲P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01;与辛伐他汀组比较，★P＜0.01。

组别 n 8周末 10周末空白对照组6 23.00 ±2.44 22.12 ±2.59模型对照组 6 39.23±6.47☆ 38.67±6.13▲养心颗粒组 6 36.83±3.48☆ 25.57±3.81▲△★辛伐他汀组 6 37.38±6.29☆ 27.50±4.40▲△

3 讨论

巨噬细胞游走抑制因子是较早发现的淋巴细胞因子之一，并一直认为只有活化的T淋巴细胞才能产生。研究表明［4］，MIF主要来源于单核巨噬细胞，是炎症性疾病中的一种关键介质，其可以通过诱导黏附分子的产生，抑制内膜下聚集的巨噬细胞的移动，促进它们在炎症部位集聚、增殖以及分泌炎性细胞因子，从而促进粥样斑块的形成和进展，导致动脉粥样硬化产生。MIF增高可促进冠状动脉粥样硬化斑块的形成及进展。

易损斑块发生破裂或血栓形成可导致临床急性冠状动脉事件的发生。而纤维帽强度是决定斑块稳定性的重要因素，纤维帽内胶原减少则是引起纤维帽强度降低的主要原因。基质金属蛋白酶家族的成员可降解胶原，研究证实，MIF可以促进基质金属蛋白酶家族成员的表达，参与减弱纤维帽厚度，导致斑块不稳定性增加。因此，MIF增高能够促进斑块不稳定性增加［5］。

本实验拟观察p53基因转染易损斑块家兔动物模型组服用益气养心安神法组成的中药养心颗粒前后MIF水平的变化，分析它们之间的关系，探讨养心颗粒稳定斑块的可能作用机制，为广泛的临床应用提供理论依据。

［1］ 吴茜，肖杰.益气活血、养心安神治疗胸痹证54例［J］.中国中医药科技，2005，12(6):38.

［2］ 钱亚东，叶炳华，管耘园.球囊损伤、高脂喂养加野生型p53基因转染建立兔颈动脉易损斑块模型［J］.实用医学杂志，2007，23(1):33－36.

［3］ 陈文强，张运，张梅，等.外源性人野生型p53基因转染导致兔动脉硬化斑块的不稳定性［J］.中华医学杂志，2004，84(1):43 －47.

［4］ 余细勇，陈红梅，林秋雄，等.巨噬细胞移动抑制因子在动脉粥样硬化斑块中的表达［J］.中国动脉硬化杂志，2007，15(7):555.

［5］ 杨丽霞，苗贵华，齐峰，等.冠心病患者血浆激活蛋白－1、巨噬细胞游走抑制因子水平和冠状动脉病变的关系［J］.中国介入心脏病学杂志，2009，17(5):263.