高效液相色谱－串联质谱法研究环维黄杨星D分散片的生物利用度＊

陈日来，李玉珍，谢守霞，李 东，王大果，李衡梅

(1.广东省深圳市福田区第二人民医院，广东 深圳 518049; 2.广东医学院附属福田医院，广东 深圳 518033;3.暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院，广东 深圳 518020)

环维黄杨星D(cyclovirobuxine D，CVB－D)又称黄杨宁、环常绿黄杨碱D、黄杨碱等，是从黄杨木中提取的生物碱，属孕甾烷衍生物，分子式为C26H46N20，具有行气通络止痛功能，主要用于治疗气滞血瘀所致胸痹心痛、脉结代、冠心病、心律失常[1]。CVB－D是继麻黄素和青蒿素之后，从我国中药宝库中发掘出来的又一个具有划时代意义的单体化合物，有良好的应用前景[2]。但有关CVB－D在犬、兔、大鼠和人体内的药代动力学研究[3－12]提示，其不同剂型的相同剂量在同一物种中的药代动力学参数个体差异非常大;黄杨宁用于治疗冠心病心绞痛具有即时疗效，但血药浓度极低。因此，在黄杨宁的新型制剂研究中，建立灵敏度高的测定方法并研究其药代动力学规律，对于制剂疗效稳定性与用药安全评价等均具有重要的意义。笔者应用高效液相色谱－串联质谱(HPLC－MS2)法，建立了简便灵敏地测定生物样品中CVB－D的方法，并研究了其分散片与普通片的相对生物利用度，为分散片的临床应用提供了参考依据。

1 材料与试药

Thermo Finnigan LCQ液质联用仪(带自动进样器和Xcalibur软件);Allegra 64R型离心机(美国贝克曼库特有限公司)。CVB－D对照品(中国药品生物制品检定所，批号为888－200202，纯度大于94%);内标左羟丙哌嗪对照品(深圳海王药业有限公司，批号为05021011，纯度大于99%);有机溶剂均为色谱纯，去离子水由Purelab classic纯水系统(ELGA Labwater，France)制备。受试制剂CVB－D分散片(自制，批号为091101，规格1 mg/片);参比制剂黄杨宁片(南京小营制药厂，批号为2010612，规格1 mg/片)。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱柱:Hyperity C18柱(150 mm ×2.1 mm，5 μm)，柱温:40 ℃;流动相:10 mmol甲酸铵－甲醇－0.1%甲酸(20∶50∶30);流速:0.2 mL/min;自动进样器温度:4℃。电喷雾(ESI+)方式检测(能量级为28%);喷雾电压:5 kV;毛细管温度:300℃;鞘气流以及辅气流分别为35和5，用于定量分析的离子对分别为 m/z 403.0→372.2(CVB － D)和 m/z 235.3→219.1(内标)。

2.2 样品处理方法

取血浆1 mL，加100 μL质量浓度为43.6 pg/mL内标，再加入50 μL 50%的氨水，混匀 20 s，加入 5 mL三氯甲烷，震荡 3 min，以2 600 r/min离心10 min，取下清液3.5 mL，置干净玻璃管，于40℃水浴氮气吹干，最后残渣用100 μL流动相溶解，进样20 μL。

2.3 方法学考察

专属性考察:空白血浆、空白血浆加对照品和用药后血浆样品色谱图见图1。可见，CVB－D、左羟丙哌嗪的保留时间分别为2.7 min和3.0 min左右，血浆中内源性物质不干扰测定，专属性强。ESI+条件下质谱扫描见图2。

图2 质谱扫描图

标准曲线绘制:配制含CVB－D质量浓度分别为 10，20，40，80，120，160，320 pg/mL 的血浆样品，按 2.2项下方法处理。以 CVB－D峰面积与内标峰面积之比(Y)为纵坐标、血浆中CVB－D质量浓度(C)为横坐标制作标准曲线。得回归方程Y=0.000 308 625 C+0.001 84909，r=0.996 9(n=7)，权重系数为1/X。结果表明，CVB－D质量浓度线性范围是10～320 pg/mL，最小检出质量浓度为10 pg/mL。

精密度试验:分别配制CVB－D低(20 pg/mL)、中(80 pg/mL)、高(160 pg/mL)3个质量浓度的质控样品，每个质量浓度制备5份，分别在3 d内连续测定其质量浓度，计算日内、日间误差。结果见表1，可见方法有较高的精密度和准确度。

表1 精密度试验结果(n=5)

稳定性试验:根据样品采集及分析过程，同时考察了低、中、高3个质量浓度的质控样品分别在－20℃(30 d)、室温(8 h)、4℃(12 h)、反复冻融(3次)状态下的稳定性，每个浓度制备5份样品，以测得的准确度表示稳定性。结果准确度在92%～108%，表明样品在各种条件下保存均有良好的稳定性。

回收率试验:结果见表2。可见，CVB－D和内标的平均萃取回收率大于85.33%，平均方法回收率在94.30% ～104.43%之间。

基质效应考察:取离心管数支，加入1 mL空白血浆，按2.2项下方法处理，空白血浆来自6个不同个体。另取离心管数支，用纯水代替空白血浆后同法操作。计算血浆萃取物和纯水萃取物的平均峰面积比值，考察基质效应的影响。结果显示，基质对浓度信号的影响在 0.91 ～3.46%之间。

表2 回收率试验结果(n=5)

2.4 统计学方法

2.5 人体生物利用度试验

试验设计:试验方案报医学伦理委员会审批通过。健康男性志愿者 18 人，平均年龄(23.2 ±1.5)岁，平均体重(62.6 ±7.6)kg，平均体重指数(BMI)为(21.4±1.7)。所有受试者试验前常规体格检查和血液生化检查示肝脏、肾脏功能基本正常。受试期间及试验前停服所有药物，禁烟、酒。试验前受试者均签署知情同意书。受试者于试验日的前晚开始禁食12 h，第2天早晨7:30空腹开始试验。采用自身对照、随机交叉的方法，分别一次性口服受试药CVB－D分散片2片(规格为1 mg/片)或对照药黄杨宁片2片(规格为1 mg/片)，用200 mL温开水送服，服药后禁食2 h，前后两次给药间隔时间为 2 周。服药前和服药后 0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，10，12，24，48，72，120，144 h 共 16 个时间点从前臂静脉取血，每次取血4 mL，分离血浆贮存于－20℃冰箱，待分析。所有的受试者试验期间未见其他不良反应，试验结束后复查肝肾功能均基本正常。

结果:血药浓度－时间曲线见图3。药代动力学参数见表3。单剂量给药后，将受试药与对照药的 Cmax，AUC0－t，AUC0－∞进行方差分析，结果显示在制剂间均无显著性差异(P＞0.05)，服药周期亦无明显影响(P ＞ 0.05)，但个体间存在明显差异(P ＜ 0.01)。统计结果显示，AUC0－t的置信区间 为 84.5% ～112% ，AUC0－∞的置信区间为88.9% ～105%，Cmax的置信区间为93%～108% ，均符合等效标准;Cmax，AUC0－t，AUC0－∞的双向 t检验结果同样符合等效标准;tmax经非参检验，结果合格。因此，受试药与对照药具有生物等效性。

图3 血药浓度－时间曲线

3 讨论

与已有的方法[13]比较，本研究建立的测定方法检测灵敏度高、样本量少、分析时间短，CVB－D和内标的保留时间分别为2.0 min和2.7 min左右，大大缩短了分析时间，适合大批量样本的分析处理。含CVB－D的血浆需经碱化后再用有机溶剂提取，经考察发现，碱量适当加大，有利于提取完全，因此用50%的氨水进行碱化，再分别用5 mL乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷提取。结果表明，用三氯甲烷提取，基线噪音低，提取回收率较高，溶剂易挥干。根据CVB－D的结构特征，筛选了许多内标物，结果以左羟丙哌嗪为内标物，峰形好，与被测物及血浆中内源性物质分离完全，测定结果准确。

表3 主要药代动力学参数(±s，n=18)

表3 主要药代动力学参数(±s，n=18)

药动学参数AUC0－36(ng·h/mL)AUC0－∞ (ng·h/mL)Cmax(ng/mL)tmax(h)t1/2(h)F(%)受试制剂5 679.83 ± 1 548.21 7 464.21 ± 2 128.08 202.81 ± 43.30 5.76 ± 1.93 54.67 ± 12.43 99.4 ± 8.3参比制剂5 243.65 ± 1 317.39 7 021.43 ± 2 076.12 222.10 ± 50.90 5.22 ± 1.03 50.66 ± 13.63

人血浆中药物浓度测定结果表明，两种不同剂型的CVB－D在给药后4 h血药浓度达到最大，给药后约48 h出现较明显的血药浓度回升的双峰现象，考虑为肠肝循环的原因。本研究结果显示，药物的分布较迅速，消除速率较慢。由此可见，CVB－D在人体内作用维持时间较长，有利于心血管疾病的治疗。

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