结球甘蓝西园4号种子纯度的SSR鉴定

苗明军 李成琼 司 军 任雪松 宋洪元

（1西南大学园艺园林学院，重庆市蔬菜学重点实验室，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715；2四川省农业科学院园艺研究所，四川成都 610066）

结球甘蓝西园4号种子纯度的SSR鉴定

苗明军1，2李成琼1*司 军1任雪松1宋洪元1

（1西南大学园艺园林学院，重庆市蔬菜学重点实验室，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715；2四川省农业科学院园艺研究所，四川成都 610066）

利用SSR分子标记技术对结球甘蓝西园4号及其亲本的DNA进行扩增，从90对SSR引物中筛选出1对具有双亲条带差异明显的引物O112-G04，构建了清晰的DNA扩增指纹图谱，并对西园4号种子进行了纯度鉴定，与田间形态学的鉴定结果高度一致，种子纯度均为96.7 %。结果表明，利用这对引物对结球甘蓝西园4号种子的纯度鉴定是可行的。

结球甘蓝；SSR标记；纯度鉴定

结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）是我国重要的蔬菜作物之一。西园4号是利用自交不亲和系配制的秋甘蓝一代杂种，在西南地区栽培面积较大。由于制种过程中管理措施不当和自交不亲和性本身的缺陷常会产生自交种子，即假杂种。纯度不高的种子会对生产造成很大损失，因此，对甘蓝种子进行纯度鉴定是非常必要的。形态学鉴定受周期长、成本高、环境条件等因素制约。

分子标记技术的快速发展为种子的纯度鉴定提供了一种更为快速、高效的方法（方宣钧 等，2000；Yashitola et al.，2002）。SSR分子标记信息含量高，重复性好，广泛、随机、均匀地分布于整个基因组，呈共显性遗传，利用杂交种双亲在一些SSR标记位点的差异，可以将具有父母本互补带型的杂交种与其双亲、甚至一些异源花粉造成的杂交种区分开（李召华 等，2006）。目前，RAPD标记（庄木 等，1999）和 AFLP标记（田雷 等，2001）在甘蓝种子纯度鉴定方面已有应用，SSR标记在甘蓝种子纯度鉴定中鲜见报道，本试验利用SSR标记技术构建西园4号及亲本DNA指纹图谱，筛选出共显性引物，建立快速、稳定的SSR分子标记种子纯度检测技术体系，并与田间形态学鉴定结果进行比较，为甘蓝杂交种纯度鉴定提供理论基础。

1 材料与方法

杂交种:西园4号，小区隔离制种，亲本:母本E1，父本C1，均由西南大学十字花科蔬菜研究所提供。2009年7月在西南大学十字花科蔬菜研究所实验基地播种，SSR标记鉴定在西南大学重点实验室进行。DNA提取采用CTAB方法（王掌军和马骏，2008），并加以改良。甘蓝幼苗长出3～4真叶时，采用改良后的CTAB方法提取基因组DNA。

本试验按照http://www.uk.crop.net网站上公布的序列合成了90对甘蓝类蔬菜SSR引物，由上海生工生物工程服务有限公司合成。SSR扩增反应体系（司军 等，2009）为10 μL，1×Buffer（含20.00 mmol·L-1MgCl2），50.00 μmol·L-1dNTPs，模板 DNA（50 ng·μL-1），0.4 UTaqDNA聚合酶（2 U·μL-1），0.4 μmol·L-1SSR引物，1.00 μL DNA，加ddH2O至终体积10 μL。扩增反应在Mastercycle gradient梯度PCR仪上进行，94 ℃预变性5 min后进行20个迫降循环，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，每个循环降低0.5 ℃；再进行15个循环，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。扩增产物采用8 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，采用银染显色，观察并照相记录。

田间父母本各种植40株，各分两个小区，西园4号种植60株，分3个小区。西园4号单株挂牌编号，分别在苗期、结球期进行形态学调查。

2 结果与分析

2.1 田间种子纯度鉴定

田间调查结果发现，父母本分别在苗期和结球期各调查40株，异形株率为0。杂交种西园4号在苗期调查60株，异形株率为0；结球期调查发现有2株为异形株，异形株率为3.33 %，杂交种西园4号的纯度为96.7 %。异形株的编号分别为8号植株和25号植株。8号植株与母本性状一样，叶柄短、蜡质厚、纵横径较小、叶球偏小、内缩短径短。25号植株与父本表型性状一样，叶色灰绿、蜡质厚、纵横径大、叶球偏大、内缩短径长。

2.2 SSR标记种子纯度鉴定

2.2.1 DNA提取与检测 利用改良CTAB方法提取的 DNA经0.8 %的琼脂糖凝胶电泳检测和采用超微量核酸蛋白测定仪测定样品浓度，OD值均在1.8～2.0之间，琼脂糖电泳条带清晰，无拖尾现象（图1）。说明所提取的 DNA纯度高、质量好。

2.2.2 特征型引物的筛选 引物的筛选是SSR标记进行杂交种纯度鉴定的一个关键的技术前提。本试验利用SSR标记技术在90对引物中筛选出22对多态性引物，共扩增出92条清晰、可重复性条带，每对引物扩增条带数为2～6条。其中69条为具有多态性的条带，多态性百分率为75 %。平均多态性条带为3.14条。最后筛选出1对具有共显性的引物O112-G04，即能在亲本C1和E1之间扩增出互补的特异谱带，谱带间大小差异明显，很容易将杂交种与其亲本分辨开，多次重复，结果稳定。这对引物可用于西园4号种子纯度鉴定。引物序列为:（正）CGAACATCTTAGGCCGAATC（反）GGTTAAC CTGCGGGATATTG特征引物筛选如图2。

图1 部分甘蓝样品基因组DNA的检测结果

2.2.3 纯度鉴定 利用筛选出的 SSR引物O112-G04对60个西园4号单株及其父母本进行SSR标记纯度鉴定，从图3中可以看出，8、25号植株属于非真实杂交种，8号植株缺少父本特异条带，与母本扩增图谱一样，说明8号植株为母本苗，25号植株缺少母本特异条带，与父本扩增带型相同，说明它是父本苗。西园4号杂交种纯度为96.7 %。田间形态学鉴定结果与SSR标记杂交种纯度检测结果一致，说明利用SSR标记进行种子纯度鉴定可以准确反映杂交种的真实纯度。

图2 引物O112-G04对西园4号及其亲本的扩增结果

图3 引物O112-G04在部分西园4号单株及其亲本中的扩增结果

3 结论与讨论

本试验通过对两种纯度鉴定结果的比较分析发现，田间形态学调查与SSR标记纯度鉴定结果一致，种子纯度都是96.7 %。说明利用SSR标记进行纯度鉴定可以准确反映杂交种的真实纯度。西园4号为秋甘蓝，5月下旬收获种子，7月上旬用于生产上播种，采用田间形态学鉴定种子纯度，费时、费工，且影响杂交种的及时销售和农民生产，因此建立一套快速、准确的种子质度检测体系是非常必要的。本试验采用的10 μL SSR扩增反应体系与25 μL RAPD、AFLP体系相比成本较低。采用SSR标记技术进行杂交种纯度鉴定实质是检测杂交种及其亲本基因组DNA的差异，检测所需时间短，对DNA的质量要求不高，结果准确、稳定，不受环境等因素的限制。

本试验利用SSR标记筛选出稳定的O112-G04引物，构建了西园4号及其亲本的DNA指纹图谱，其鉴定结果与田间纯度鉴定结果一致，利用SSR标记建立的快速种子纯度检测体系鉴定甘蓝种子纯度是可行的，为辨别和鉴定假冒伪劣种子提供科学依据。

方宣钧，刘思衡，江树业.2000.品种纯度和真伪的DNA分子标记及其应用.农业生物技术学报，（2）:106-110.

李召华，朱克永，陈祖武，詹庆才.2006.SSR分子标记技术在杂交水稻种子纯度鉴定中的应用.杂交水稻，21（4）:11-14.

司军，李成琼，宋洪元，任雪松，宋明，王小佳.2009.结球甘蓝SSR检测体系的建立及优化.中国蔬菜，（12）:19-23.

田雷，曹鸣庆，王辉，郭晶心，周乃元，孙江，贾希海.2001.AFLP标记技术在鉴定甘蓝种子真实性及品种纯度中的应用.生物技术通报，（3）:38-40.

王掌军，马骏.2008.甜瓜基因组DNA的提取及质量检测.宁夏农林科技，（3）:29-30.

庄木，王晓武，杨丽梅，刘玉梅，孙培田，方智远.1999.利用RAPD方法鉴定两个春甘蓝品种的纯度.中国蔬菜，（5）:8-9.

Yashitola J，Thirumurugan T，Sundara R M，Naseerullah M K，Ramesha M S，Sarma N P，Sonti Ramesh V.2002.Assessment of purtity of rice hybrids using microsatellite and STS markers.Crop Science，42（4）:1369-1373.

Identification of Cabbage‘Xiyuan No.4’Seed Purity by SSR Markers

MIAO Ming-jun1,2, LI Cheng-qiong1*, SI Jun1, REN Xue-song1, SONG Hong-yuan1
（1College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Key Lab in Olericulture of Chongqing,Key Lab of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing400715, China;2Horticulture Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences Chengdu610066, Sichuan, China）

Cabbage（Brassica oleracea L. var. capitata L.）‘Xiyuan No.4’and its parent were analyzed by SSR molecular marker technology. A primer, with obvious different bands parent, O112-G04 was screened from90 pairs of SSR primers. The DNA fingerprinting of cabbage‘Xiyuan No.4’was constructed, and its seed purity was identified. The result is consistent with those obtained in the field tests. The seed purity was96.7 %.This result shows that it is reliable to use this pair of SSR primer to identify cabbage‘Xiyuan No.4’seed purity.

Cabbage; SSR marker; Purity test

S635.1

A

1000-6346（2011）02-0053-03

2010-06-25；接受日期:2010-10-09

重庆市科委攻关项目（CSTC,2010AA1023），农业科技成果转化资金项目（2009F10010355），西南大学博士基金资助项目（SWUB2008058），中央高校基本科研业务费资金项目（XDJK2010C068，XDJK2010C069）

苗明军，男，硕士研究生，专业方向:蔬菜遗传育种与生物技术，E-mail:miaomingjun11@126.com

*通讯作者（Corresponding author）:李成琼，教授，专业方向:蔬菜遗传育种与生物技术，E-mail:chqli@swu.edu.cn