南非II型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立

邓俊花，吴绍强，林祥梅

（中国检验检疫科学研究院，北京 100029）

口蹄疫病毒（FMDV）属小RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus）的成员。FMDV能广泛引起偶蹄动物的发热、口腔黏膜、乳房以及蹄部皮肤出现水泡。该病传播力强，分布范围广，给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失。

随着我国与非洲等南非型（SAT型）口蹄疫疫区贸易频繁，特别是2000年科威特、沙特阿拉伯暴发了SATⅡ型口蹄疫疫情[1]，我国口岸面临的南非型特别是SATⅡ型口蹄疫防控形势十分严峻。

ELISA试验检测口蹄疫蹄疫具有特异、敏感、快速、简便、可靠性好等特点，在FMD的诊断中日益受到人们的重视，现已成为国际上检测FMD的常规方法之一。丹麦的Sorensen等[2]开发出的 ELISA可分别检测非结构蛋白 3AB，3ABC，3D，其中 3AB，3ABC，3D ELISA均可检测FMDV的7种血清型病毒抗体。德国的Bruderer[3]也成功的建立了3ABC ELISA方法。Kweon等[4]以杆状病毒表达的非结构蛋白3A为抗原，以抗3A的单抗作为捕获抗体，建立起间接捕获ELISA方法，适合诊断FMDV的感染。Bergmann比较了以3A，3B，2C和3ABC为抗原的ELISA方法检测感染牛的敏感性和准确性，结果证实特异性为96%，对148份感染FMDV的猪、牛和羊的血清进行检测，证实其敏感性大于99%，特异性和灵敏性满足ELISA的检测要求。Lomakina等[5]建立了检测FMDV的PCR-ELISA方法成功的检测到32株口蹄疫病毒株。但是，国内尚未有南非型口蹄疫的血清学检测方法。

本实验室李雅静等分析了SAT II型FMDV抗原表位，合成8条多肽进行试验，筛选出6条抗原性良好的多肽[6]。本研究将以上6条多肽进行拼接得到VP1～VP3抗原，建立了SATⅡ型FMDV间接ELISA检测方法，为口蹄疫的诊断及流行病学调查提供新的技术支持，为口蹄疫的防控监测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

SATⅡ型 FMDV阳性灭活血清由英国Pirbright口蹄疫参考实验室提供；口岸出境动物血清，经口岸检测为口蹄疫抗体阴性，由本实验保存。

1.2 主要试剂

MagneGST Cell Lysis Reagen购自Promega;Glutathione Sepharose TM-4B购自Amersham Biosciences公司；Thrombin Cleavage Capture Kits购自Novagen公司;HRP标记的兔抗牛IgG二抗购自北京鼎国生物技术公司。

1.3 诊断抗原（VP1～VP3）的制备

本实验室将筛选出的6条多肽按照其自然顺序拼接，人工合成相应表位基因并进行体外表达。诱导表达按照文献[7]方法进行。离心收集1.0 mmol/L IPTG诱导 6 h的表达菌液（命名为pGEX-VP1～VP3），加入 MagneGSTCell Lysis Reagent和RNase-Free DNase I进行裂解。将裂解液与Glutathione Sepharose TM-4B匀浆液2:1比例混匀，吸附，除去杂蛋白。按Thrombin Cleavage Capture Kits操作说明，加入酶切反应体系，进行柱上酶切，于20.5℃反应12 h。收集酶切产物，透析纯化，测定浓度。同时通过SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯化效果。

1.4 间接ELISA方法建立

将纯化好的VP1～VP3抗原以合适的浓度包被，37℃孵育2 h。洗涤后用1%明胶的封闭液37℃封闭2 h。将待检血清用含0.1%鸡卵清白蛋白的PBST稀释后加入到洗涤后的酶标版上，37℃孵育1 h，同时设标准阴性、阳性血清对照孔，每个样品2个重复。加入HRP-兔抗牛IgG二抗，37℃孵育1 h。洗涤后加入TMB溶液，37℃，避光反应15 min，用1 mol/L H2SO4溶液终止反应，测定光密度吸收值（OD450）。

1.4.1 抗原包被浓度和血清最佳稀释度确定

抗原（0.1μg/mL～12.8μg/mL）以2倍梯度稀释，SATⅡ标准阳性血清做 1:50、1:100、1:200……1:6 400稀释，进行方阵滴定试验，根据450 nm读数值，按照阳性值（P）/阴性值（N）最大，阴性本底最低的原则，确定抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数。

1.4.2 HRP-兔抗牛IgG酶标二抗最佳稀释度确定

以抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数进行试验，将HRP-兔抗牛IgG酶标二抗分别做1:1 000、1:2 000、1:4 000……1:32 000倍比稀释，按以上方法进行间接ELISA检测。读取450 nm读数值，按照P/N值最大的原则，确定HRP-兔抗牛IgG酶标二抗最佳稀释度。

1.4.3 阴性临界值确定

随机选取31份本实验低温保存的已知为阴性的血清样品进行ELISA测定，对测定结果方差分析，并根据以下文献[8]设定临界值（Q）:Q=阴性样品平均OD450值+3SD（SD 为标准方差）。Q1=阴性样品平均OD450值+4SD，Q2=阴性样品平均OD450值+2SD。P（样品OD450）＞Q1判为阳性;P＜Q2判为阴性，Q2≤P≤Q1判为可疑。对可疑样本需要重新测定，如果结果仍为可疑，判定为阳性。

1.4.4 特异性检测

按上述建立的间接ELISA法检测SAT I、SATⅢ、O、A、C和 Asia I型 FMDV标准阳性血清，设SAT II型FMDV血清作为阳性对照，胎牛血清为阴性对照。血清按1.4.1确定的稀释倍数稀释，进行ELISA检测，验证FMDV各亚型之间是否存在交叉反应。

2 结果

2.1 pGEX-VP1～VP3融合蛋白柱上酶切检测

pGEX-VP1～VP3重组菌的表达产物经裂解，酶切，透析纯化后，得到所需目的抗原（VP1～VP3蛋白），大小约 12.3kDa（图 1）。

2.2 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

经棋盘分布法所得数据分析，依据节约抗原，减少血清稀释影响，最终确定最佳抗原的包被浓度为6.4μg/mL，血清最佳稀释浓度为1:200（表1）。

2.3 HRP-兔抗牛IgG酶标二抗最佳稀释度的确定

结果见表2。当HRP-兔抗牛IgG酶标二抗以1:4 000稀释时，P/N值最大（为11.54）。

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2.4 阴性临界值判断标准确定

随机选取31份实验室保存的已知为阴性的血清样品，进行ELISA测定。测得OD450值介于0.312～0.501之间。经SPSS11.5分析，阴性样品平均OD450值为 0.382，SD=0.060，因此，Q= 平均数 +3SD=0.562。为了减少假阳性或假阴性结果，将临界值加上或减上1个标准差的范围作为一个可疑区间（即0.502≤OD450≤0.622），介于可疑区间的结果需要重检。根据统计学原则，OD450＞0.622时，可信度在99.9%以上为阳性，OD450＜0.502，可信度在99.9%以上为阴性，能够作为检测结果的判断标准。

2.5 特异性试验

经SPSS 11.5软件分析，SAT II标准阳性血清与其它亚型标准阳性血清和阴性血清差异极其显著（P＜0.01），并且其它亚型血清OD450均小于0.502（表3），这表明SAT II血清型的FMDV抗体与其它血清型的FMDV抗体无交叉反应。

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3 讨论

3.1 近年来，将口蹄疫病毒主要抗原表位基因进行串联表达是口蹄疫研究中的热点。Mayr等[9]构建了结构蛋白P1和非结构蛋白2A、3C多抗原腺病毒表达质粒，免疫动物后，能诱导T细胞反应和抗体的生成，且对FMDV的攻击起到保护作用。杜以军等[10]表达了 O 型 FMDV VP1（21-60）-（141-160）-（200-213）位氨基酸的基因，Western-Blot结果表明，此多抗原表位串联蛋白能够被O型FMDV阳性血清识别，显示了良好的反应原性。在国内外学者大量研究口蹄疫病毒抗原表位的基础之上，本研究选择了SATⅡ型FMDV结构蛋白VP1、VP2、VP3上可能的抗原表位，将其用柔性氨基酸串联，尽可能保持抗原表位各自的构象及功能，在大肠杆菌中实现了融合表达。相对于只表达VP1或其上的主要抗原位点基因，此串联表达具有更多的优势。

3.2 去除融合蛋白融合标签的方法主要有化学裂解法和酶解法[11-12]。化学裂解法特异性不强，现已较少使用；酶特异性极高，是去除融合标签的首选。在工具酶使用比例相同的情况下，固相柱上酶切效率均可超过液相酶切，而亲和柱未饱和时，酶切效率更高。在制备诊断抗原时，本研究采用两种酶切方式：磁微粒纯化融合蛋白后直接液相酶切，然后回收目的蛋白，再进行透析纯化。另一种方法是表达产物直接裂解后，层析柱吸附，直接柱上酶切，对酶切产物进行透析纯化。从实验结果中可以看出，柱上酶切方法操作简单，酶切纯度高，没有杂蛋白干扰，并且回收率很高。

3.3 在建立ELISA方法时，非特异性反应是影响ELISA结果最重要的因素，降低非特异性反应尤为重要。在消除非特异性反应过程中，洗涤效果，封闭液选择很重要。本实验采用明胶进行封闭，取得良好效果。另一方面，ELISA方法中结果的判定与特异性和敏感性密切相关，目前还没有统一的判定标准，一般公认的判定方法是通过检测大量已知阴性样品，用统计学方法计算结果的平均数、平均数的99%可信区间和标准差，确定一个在99%的可信度上区分阴、阳性结果的临界值[8]。本试验中，从已知阴性样品中随机选取31份进行阴性临界值确定，临界值为0.562。通过特异性实验和临床样本的检测结果也验证了阴性临界值的可靠性。此外，本试验还设定了一个可疑值范围，对介于可疑区内的样品进行重检，降低了假阳性或假阴性结果机率。

[1]马世春.口蹄疫已成为全球性威胁 [J].中国牧业通讯，2001，9：37.

[2]Sorensen K J，Madsen K G.Madsen E S，et al.Differentiation of infection from vaccination in foot-and-mouth disease by the detection of antibodies to the non-structural proteins 3D，3AB and 3ABC in ELISA using antigens expressed in baculovirus[J].Arch Virol，1998，143（8）：1461-1476.

[3]Bruderer U，Swam H，Haas B，et a1.Differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth-disease：evaluation of an ELISA based on recombinant 3ABC[J].Vet Microbio1，2004，101（3）：187-197.

[4]Chang Hee Kweon，Young Joon Ko，Won IIKim，et al.Development of a foot-and-mouth disease NSPELISA and its comparison with differential diagnostic methods [J].Vaccine，2003，21：1409-1414.

[5]Lomakina N F，Fallacara F，Pacciarini M，et al.Application of universal primers for identification of Foot-and-mouth disease virus and Swine vesicular disease virus by PCRand PCR-ELISA[J].Arch Virol，2004，149（6）：1155-1170.

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