轻、中度持续哮喘患者治疗前后气道高反应性及致气道重塑细胞因子变化研究

武虹艳，万毅新，王晓平，陶红艳，魏海东，王 虹，黄晖蓉，李芳伟

支气管哮喘是以气道慢性炎症、气道高反应性 (BHR)以及可逆性气流受限为特征的慢性疾病。气道慢性炎症和气道重塑被认为是导致气道高反应性的关键。气道重塑最终导致哮喘患者气流受限不可逆，上皮下纤维化是气道重塑最主要的特征，而Thl和Th2细胞亚群失衡，即Th2型优势应答在上皮下纤维化的形成过程中发挥重要作用。转录因子T－bet和GATA－3是特异性调控Th0分化为Thl、Th2的关键因子。尽管哮喘的这些特性已被人们所认识，但是导致气道重塑的机制和药物治疗在减缓并阻止气道重塑的效果并不十分清楚。大量的细胞和细胞因子参与气道炎症及气道重塑的形成，形成一个复杂的网络。TGF－β1被认为是气道炎症和气道重塑的关键调节因子。本研究通过检测轻中度持续哮喘患者长期吸入小剂量布地奈德粉剂治疗前后气道高反应性的变化，气道黏膜组织中TGF－β1、T－bet及GATA－3的表达及其相关性，试图探讨治疗前后轻、中度持续哮喘患者气道高反应性及致气道重塑细胞因子表达的变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料 哮喘组:选取2006年6月—2009年6月就诊于兰州大学第二医院呼吸内科的轻、中度持续哮喘患者28例，胸片无异常表现，诊断标准符合中华医学会呼吸病学分会2003年《支气管哮喘防治指南》。其中男16例，女12例，平均年龄 (52.69±15.75)岁，平均身高 (165.28±9.84)cm，平均体质量 (65.23±14.65)kg。28例患者均符合以下入选条件:(1)年龄25～85岁;(2)无心、肝、肾功能不全和精神异常;(3)非孕妇或哺乳期妇女;(4)纳入前无吸入糖皮质激素治疗史。对照组:选择2006年6月—2009年6月就诊于兰州大学第二医院体检中心的健康体检者10例，无哮喘病史，肺功能正常。其中男6例，女4例，平均年龄 (49.92±14.83)岁，平均身高 (168.52±7.92)cm，平均体质量(68.33±13.46)kg，两组患者一般资料间有均衡性。

1.2 研究方法

1.2.1 气管镜检查方法与标本采集 气管镜操作依据BTS指南［1］进行，受试者术前应用2%利多卡因做口咽部局麻。应用电子支气管镜在右肺下叶取支气管黏膜组织3～4块置于10%福尔马林溶液中，并用石蜡包埋。入组后哮喘患者规律吸入布地奈德200μg［商品名:普米可都保，阿斯利康 (无锡)贸易有限公司生产，生产批号:MK896，国药准字:H20080249］，2次/d，持续12个月。治疗12个月后，哮喘患者再行电子支气管镜检查并于同一部位取支气管黏膜组织2～3块，置于10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，待全部标本收集完全后进行免疫组化染色。

1.2.2 免疫组化方法及试剂 免疫组化采用SABC(Strept Avidin－Biotin Complex)法，免疫组化试剂均购买于武汉博士德公司，均为兔抗人多克隆抗体浓缩型。

1.2.3 数据采集 采用病理图像分析仪BI—2000(成都泰盟科技有限公司生产)半定量测定TGF－β1、T－bet、GATA－3表达量，以免疫组化染色平均光密度值表示。

1.2.4 肺功能与气道高反应性测定方法 使用德国JAEGER公司肺功能仪及雾化激发系统，按美国胸科协会肺功能检测标准操作。主要检测指标如下:第1 s用力呼气容积 (FEV1)、峰值呼气流速 (PEF)、1 s率 (FEV1/FVC)，测定结果以实测值占预计值的百分比表示，以校正性别、年龄、身高、体质量等因素的影响。以乙酰甲胆碱为诱发剂，激发剂浓度依次递增，以引起FEV1下降超过20%时吸入的乙酰甲胆碱浓度为激发阈值，即FEV1＜16 mg/ml判断为支气管激发试验阳性，存在气道高反应性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行分析，正态分布的计量资料以(±s)表示，两组间比较采用t检验，并应用Pearson相关分析与多元回归分析进行相关性分析。检验水准α取值0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺功能指标的改善情况 28例哮喘患者使用布地奈德粉吸入剂12个月后，PEF、FEV1、引起FEV1下降20%的激发剂浓度 (PC20)均有显著改善，差异有统计学意义 (P＜0.01)。Pearson相关分析显示，PC20与治疗前后TGF－β1、T－bet表达无相关性，但与治疗前GATA－3呈负相关 (r=－0.836，P＜0.01)，具体见表1。

哮喘组治疗前气道黏膜组织中TGF－β1的表达强度高于对照组 (t=4.51，P＜0.01)，治疗后气道黏膜组织中TGF－β1的表达强度仍高于对照组 (t=2.71，P＜0.05)，但低于治疗前气道黏膜组织中TGF－β1的表达，差异有统计学意义 (t=2.58，P＜0.05)，具体见表1。

哮喘组治疗前气道黏膜组织中T－bet的表达强度低于对照组 (t=－21.72，P＜0.01)，治疗后气道黏膜组织中T－bet的表达强度仍低于对照组 (t=－16.29，P＜0.01)，但高于治疗前气道黏膜组织中T－bet的表达，差异有统计学意义 (t=－3.81，P＜0.01)，具体见表1。

哮喘组治疗前气道黏膜组织中GATA－3的表达强度高于对照组 (t=6.16，P＜0.01)，治疗后气道黏膜组织中GATA－3的表达强度仍高于对照组 (t=4.52，P＜0.01)，但低于治疗前气道黏膜组织中GATA－3的表达，差异有统计学意义(t=2.24，P＜0.05)，具体见表1。

表1 治疗前后哮喘组与对照组各研究指标的比较(±s)Table1 Comparison of indicators between the patient group and the control group before and after treatment

表1 治疗前后哮喘组与对照组各研究指标的比较(±s)Table1 Comparison of indicators between the patient group and the control group before and after treatment

注:与对照组比较，经独立样本t检验，*P＜0.01;与对照组比较，经独立样本t检验，△P＜0.05;与治疗前比较，经配对样本t检验，▲P＜0.01;与治疗前比较，经配对样本t检验，●P＜0.05。FEV1=第1 s用力呼气容积，PEF=峰值呼气流速，FEV1/FVC=1 s率，PC20=引起FEV1下降20%的激发剂浓度

指标 哮喘组 (n=28)治疗前 治疗后 对照组 (n=10)FEV1(%pred.value) 84.75±18.40* 97.38±16.42＊▲0.28±0.01 107.79±8.10 PEF(%pred.value) 68.27±19.20* 85.56±22.11＊▲ 98.62±12.47 FEV1/FVC 74.82±11.57 78.36± 7.83 83.2± 9.36 PC20(mg/ml) 5.68± 2.81* 9.89± 6.40▲ ＞16 TGF－β1 0.30± 0.02* 0.28± 0.01Δ● 0.27± 0.01 T－bet 0.21± 0.01* 0.23± 0.01＊▲ 0.29± 0.01 GATA－3 0.34± 0.03* 0.31± 0.02＊●

2.2 细胞因子TGF－β1与转录因子T－bet、GATA－3的相关性 分别以治疗前后转录因子T－bet、GATA－3为自变量X，细胞因子TGF－β1为应变量Y建立回归方程。采用逐步回归的方法，按α=0.05的水准，治疗前变量T－bet、GATA－3被选入。回归方程:治疗前细胞因子TGF－β1:Y=0.372－0.334X1;治疗前细胞因子TGF－β1:Y=1.152X2－0.1020，X1为治疗前变量T－bet;X2为治疗前变量GATA－3。治疗后变量T－bet、GATA－3未被选入。

3 讨论

本研究显示轻、中度持续哮喘患者长期吸入小剂量布地奈德粉剂后，PEF、FEV1较治疗前明显改善，气道高反应性较治疗前明显减低，本研究结果与目前研究结果结论一致［2］。本研究发现治疗前PC20与GATA－3呈负相关，我们采用半定量分析，没有测定血液中细胞因子的表达量，但是该研究结果与目前的研究结果一致［3］，治疗后并未发现它们之间存在相关关系。Boulet等［4］提出假设认为气道高反应性反映了气道慢性炎症和气道重塑之间的复杂关系，很难用简单的相关关系解释复杂的临床结果与病理过程之间的关系。因此，我们推断气道高反应性的发生不仅与气道炎症及气道平滑肌功能紊乱有关，还有许多细胞因子参与，有待于进一步研究。本研究显示哮喘组TGF－β1表达高于对照组。目前关于哮喘患者气道黏膜中TGF－β1表达的结论并不一致，Torrego等［5］关于人气道黏膜中TGF－β1表达的研究结果显示，TGF－β1表达并没有规律性;但多数研究结果显示TGF－β1表达在哮喘患者的支气管黏膜中增加［6－7］。研究结果不一致的原因并不十分清楚，但是以上研究均采用免疫组化的方法，该研究方法步骤较多，任何一个步骤出现偏差都会影响实验结果。本研究结果提示治疗后可有效减少TGF－β1表达，与相关研究结果相一致［8－9］，哮喘患者气道黏膜中TGF－β1表达增高，导致成纤维细胞分泌大量胶原，转化生长因子TGF－β1也可促使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，后者具有更强的胶原合成能力，由此推断在临床中吸入糖皮质激素可有效抑制TGF－β1的表达，起到延缓气道重塑进程的作用。

本研究显示哮喘组转录因子T－bet的表达与对照组相比明显减少，治疗后其在支气管黏膜中的表达较治疗前有所增加，但其表达仍低于对照组。本研究显示哮喘组转录因子GATA－3的表达，与对照组相比明显增加，治疗后其表达较治疗前有所减少，但仍高于对照组。本研究结果提示吸入小剂量布地奈德粉吸入剂可有效增加轻、中度持续哮喘患者气道黏膜中具有负性调节Th2优势应答作用的转录因子T－bet表达，并减少促进Th2优势应答作用的转录因子GATA－3的表达，该研究结果与Liberman等［10－11］研究结果相一致。

TGF－β1、T－bet、GATA－3均被认为在气道重塑的过程中发挥了重要作用［12－14］，但T－bet、GATA－3在气道重塑形成过程中发挥的准确作用并不清楚，本研究通过分析它们之间的相关关系发现治疗前T－bet的表达与TGF－β1呈负相关;GATA－3的表达与TGF－β1呈正相关。因此我们设想转录因子T－bet、GATA－3在调控Th0细胞的分化中受TGF－β1的影响，即TGF－β1通过调控T－bet、GATA－3的表达从而间接调控Th0细胞的分化。治疗后TGF－β1、T－bet、GATA－3的表达均有改变，但它们之间并没有明显的相关关系，本研究通过观察肺功能参数及免疫组化的参数在治疗前后的变化，间接研究吸入糖皮质激素对气道重塑的影响。由此我们推断长期吸入小剂量布地奈德对哮喘患者致气道重塑的细胞因子均有影响，但其受影响程度不同。由于以上因子只是哮喘气道高反应性及气道重塑形成过程中发挥调控作用的一小部分因子，因此，简单的从实验数据的相关性来推断它们之间存在的复杂关系仍不可取。根据本研究的数据、结果以及相关研究资料，我们认为TGF－β1在调节T－bet、GATA－3平衡中发挥着重要作用，但最终结果是由微环境以及多种细胞因子、转录因子共同决定的，甚至在不同的微环境中，其受调控方向也不同，其中一定有更为复杂的细胞因子网络在发挥作用，还需要进一步研究。

哮喘患者气道黏膜中的确存在TGF－β1的表达紊乱与T－bet、GATA－3表达失衡，长期吸入小剂量布地奈德可有效改善轻、中度持续哮喘患者的肺功能指标，降低气道高反应性，抑制致气道重塑细胞因子的表达，调节T－bet、GATA－3表达失衡。

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