PGPR植物促生菌ASP-15浸种效果初探*

吴皓琼，牛彦波，殷 博，甄 涛

（黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨150010）

近10年来植物根圈促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)制剂越来越受到人们的青睐[1]。植物根圈促生菌是指自由生活在土壤或附生于植物根的一类可促进植物生长及其矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害微生物的有益菌类。一般具有固氮、解磷、释钾、产生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一的能力。PGPR对土壤中有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物都有生防作用，对植物吸收利用矿物质营养有促进作用，并可以产生有益于植物生长的代谢产物，从而促进植物的生长发育[2]。目前，有关植物促生菌PGPR的研究非常活跃，研究领域也非常广泛，已从20多个种属的根际细菌中鉴定出了具有防病促生潜能的PGPR菌，其中研究较多、较活跃的有假单孢菌属（pseudomonas）和芽孢杆菌属（bacillus）[3-5]。本项目组分离筛选的代号ASP-15产酸克雷伯氏（Klebsilla oxytoca）菌，兼具解磷、固氮及抑制病原真菌生长的功能，具有很好的应用潜力[6，7]，本文研究比较了其不同稀释倍数发酵液浸种对作物种子生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）

代号ASP-15,由本项目组分离、保藏。

1.1.2 试剂

常规化学试剂为国产分析纯。

1.1.3 仪器设备

电热恒温培养箱；干燥箱；空气浴振荡器；超净工作台（1级）；电子天平；数显型酸度计；手提式蒸汽消毒器；显微镜等。

1.1.4 培养基

斜面培养基配方采用肉汤培养基；摇瓶培养基配方采用糖蜜-玉米浆培养基(糖蜜15.0～20.0g，玉米浆 1.0～1.5g， 无 机 盐 0.2g，H2O 1000mL)；30℃、150r/min空气浴振荡器培养24h，经显微镜血球测定将活菌数调整在40×108～50×108cfu/mL间。

1.2 试验方法

1.2.1 ASP-15不同稀释倍数菌液浸种对种子发芽及生根的影响

在实验室条件下,随机选择颗粒饱满程度一致、健康的大豆、玉米、水稻种子，分组装入小烧杯中，编号，种子表面用1%～2%的次氯酸钠溶液进行消毒，清水冲洗干净，分别以ASP-15菌不同稀释倍数的菌液浸种。设5个处理：

处理1：ASP-15菌 原液浸种；

处理2：ASP-15菌 10倍稀释液浸种；

处理3：ASP-15菌 100倍稀释液浸种；

处理4：ASP-15菌 1000倍稀释液浸种；

处理5：清水浸种（对照CK）。

每个处理3次重复，计150粒种子。大豆、水稻、玉米每个处理分别用4.5mL、1.0 mL、7.0 mL ASP-15菌不同稀释倍数的菌液浸种30min，后用清水反复冲洗种子3次，分别置于铺有滤纸的直径9cm平皿中，25℃催芽48～96h，期间，适量补水使培养皿内滤纸保持微微潮湿状态，避免因水分不足而影响种子的生长，观察种子的发芽及生长状况。

1.2.2 ASP-15最适宜稀释倍数浸种效果

在1.2.1工作的基础上，通过对各处理种子发芽率及根长的比较分析，确定ASP-15菌浸种的最适宜稀释倍数。

选择最适宜浓度的ASP-15菌液浸种，操作同

1.2.1 ,设2个处理:

处理1：ASP-15菌 100～1000倍稀释液浸种；处理2：清水浸种（对照CK）。

每个处理3次重复，计150粒种子。观察种子的48h、72h发芽率及72h生根情况,并计算每粒种子黏附菌数。

2 结果及分析

2.1 ASP-15菌液不同稀释倍数浸种状况分析

结果见表1。从表1可以看出：ASP-15菌对作物种子的“作用”是各不相同，应用于玉米和水稻种，不同稀释倍数的ASP-15菌液都能或多或少地提高种子的发芽率及出芽时间，玉米种子浸种48h测定，处理组较清水对照组发芽率提高了12.87%～30.70%，其中100倍稀释液表现最好，发芽率达88%，较对照提高30.7%；水稻种子浸种48h，发芽率提高了6.52%～28.02%，以1000倍稀释液表现最好，发芽率达78.52%,较对照提高28.02%；应用于大豆种子，仅仅处理3明显提高了大豆种子的发芽率，48h较清水对照比提高了142.8%，72h较清水对照比提高了24.4%,而其余处理较清水对照发芽明显受到抑制,可能是ASP-15菌代谢产物高浓度状态对大豆的生长有抑制作用的缘故。根据各处理种子发芽率及生长情况，可以确定对大豆、玉米种子来说，处理3即100倍稀释液浸种效果最好；对水稻来说，处理4优势明显，为最佳。

表1 ASP-15不同稀释倍数菌液对作物种子发芽率的影响Table 1 Effect of seed germination rate by the different diluted times ASP-15 bacteria on fermented liquor

2.2 ASP-15最适宜稀释倍数浸种效果分析

结果见表2。从表2可以看出：在实验室条件下，100-1000倍ASP-15菌稀释液浸种，能够显著提高大豆、玉米、水稻种子的发芽率，特别是在发芽初期尤为明显。培养48h测定，玉米发芽率为86.8%，同对照比，发芽率提高了23.47%；大豆发芽率为68.9%，提高了34.83%；水稻发芽率为80.7%，提高了29.53%。ASP-15菌除提高种子发芽率外，对作物根也有刺激生长作用，经ASP-15菌处理的种子，其根表现为粗而长，根毛多而密。对于大豆、玉米来说，用ASP-15菌100倍稀释液浸种，培养72h，根长的测定结果表明：处理组根长分别达到36.57mm、38.86mm，比对照（清水）增加了48.48%、39.98%，差异极显著（t值6.252、5.243）；对水稻来说，1000倍ASP-15菌稀释液对水稻生根刺激作用明显，培养72 h处理组平均根长为34.59mm，对照组20.86mm，处理较对照相比，根长增加65.82%，差异极显著（t值15.106）。通过测定每毫升活菌数及各种子质量，可以得出每粒种子上吸附有ASP-15菌的个数。即大豆每粒种子至少吸附有3.6×106～4.5×106个菌、玉米每粒种子至少吸附有5.6×106～7.0×106个菌、水稻每粒种子至少吸附有8.0×104～1.0×105个菌时,ASP-15菌才能充分发挥作用(见表3)。

表2 ASP-15菌对作物种子的影响Table 2 Effect of the ASP-15 bacteria on seed

表3 每粒种子吸附ASP-15菌最低数量Table 3 The least number of the ASP-15 bacteria being absorbed into each seed

综上所述，ASP-15菌作为活菌制剂，其功效是活菌体起关键作用，因此在应用于浸种时，每粒种子上必须吸附上适宜数量的活菌，才能通过微生物在根际的物质转化和代谢产物不断形成，起到营养、促生作用。在本实验中，ASP-15菌活菌数为40×108～50×108cfu/mL时，对大豆、玉米种子来说，用100倍稀释液效果最好，每粒种子沾有不少于1×106个菌；对水稻种子来说，用1000倍稀释液浸种即可，每粒种子不少于1×105个菌，与大豆、玉米种相差一个数量级。说明应用微生物制剂时，必须考虑种子的吸附菌液的最适宜量，在充分进行实验基础上，才能确定微生物对哪些作物有作用、最佳剂量是多少，不能一概而论。

［1］戴梅，宫象辉，丛蕾，等.PGPR制剂研发现状与发展趋势［J］.山东科学，2006,19(6)：45～47.

［2］刘淑琮，冯断，于洁.植物根际促生菌的研究进展及其环境作用［J］.湖北农业科学，2009,48(11)：2882～2886.

［3］胡江春,薛德林,马成新,等.植物根际促生菌(PGPR)的研究与应用前景［J］.应用生态学报,2004,15(10):1963～1966.

［4］赵爽,刘伟成,裘季燕,等.多粘类芽孢杆菌抗菌物质和防病机制之研究进展［J］.中国农学通报,2008,24(7):347～350.

［5］张伟琼,聂明,肖明.荧光假单胞菌生防机理的研究进展［J］.生物学志,2007,24(3):9～11.

［6］牛彦波，吴皓琼.Klebsilla ASP-15拮抗真菌病害能力与抗病机理的初步研究［J］.生物技术，2009,19（3）：55～57.

［7］吴皓琼，牛彦波，殷博，等.Klebsilla ASP-15根圈促生菌发酵工艺配方及复合菌株的性能研究［J］.黑龙江科学，2010,1（5）：8～10.