自体间充质干细胞移植异体韧带重建治疗膝交叉韧带损伤

黄相杰 姜红江 孟鹏

前交叉韧带(anterior curiae ligament，ACL)在体育活动中极易损伤，其断裂后一般不能自发愈合，目前临床治疗的金标准是韧带重建术，但不管用什么移植材料只是起到模板作用，韧带移植物都要经历缺血坏死炎症期、再血管化过程、成纤维细胞增殖和植入期以及韧带的塑型改造期大致4个相连续的过程。移植物重塑改造的时间很长，有必要采取措施来加快这一进程。我院自2009年10月至2010年10月间运用自体骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)复合同种异体骨-髌腱-骨移植物重建受损的前交叉韧带，取得了满意的临床疗效，现报告如下。

1 临床资料

本组均为经过MRI检查、临床理学检查及关节镜检查证实为前交叉韧带完全断裂、同时排除了后交叉韧带损伤及内侧副韧带完全断裂的患者，且不伴有同侧肢体骨折、骨性关节炎等。2009年9月至2010年10月间，共57位患者按照随机数字分别纳入实验组和对照组进行手术治疗，出院后继续进行随访。

1.1 实验组 共31例，其中男18例，女13例;年龄19～52岁，中位年龄32.3岁。体重51～87 kg，平均63.4 kg;身高160～187 cm，平均167.9 cm。受伤因素:运动损伤11例，交通事故15例，高处摔伤5例，伤后到手术时间为3 d～22个月，中位病程10.8个月。

1.2 对照组 共26例，其中男15例，女11例;年龄18～55岁，中位年龄33.4岁。体重53～86 kg，平均65.1 kg;身高159～188 cm，平均168.7 cm。受伤原因:运动损伤8例，车辆撞伤13例，高处坠落伤5例，伤后到手术时间为7 d～23个月，中位病程11.2个月。

两组患者在性别、年龄、身高、体重、致伤原因等一般情况方面均无统计学意义。所有患者均有患膝关节不稳、疼痛、跛行、股四头肌萎缩致“打软腿”等症状。术前对患膝关节功能分别运用国际膝关节文献委员会(IKDC)评分及Lysholm评分进行评估，结果显示两组患膝关节功能评分均无明显统计学差异(见表1、2)

2 治疗方法

2.1 自体间充质干细胞培养 实验组无菌条件下在局麻下于两侧髂后上棘抽取骨髓60 ml，在200 g的条件下离心骨髓6 min，取上清液，加入等量 PBS，在1000 g的条件下离心6 min，获取有核细胞。每平方厘米接种:大约0.8～1.2×106个有核细胞，在37℃、含20%自体PRP、5%CO2浓度下进行细胞培养，每隔3 d换液，细胞长满后，消化，冻存细胞备用。

2.2 移植物准备 先将同种异体髌骨-髌腱-胫骨(中国人民解放军骨科研究所组织库提供)制成骨-髌腱-骨复合体，近端骨块修剪成直径9 mm、长2 cm的骨柱，远端骨修剪成直径10 mm的全长骨柱。再分别在两端骨柱上间隔5 mm钻2个直径1.5 mm的骨孔，用肌腱线编织缝合髌腱并从骨孔引出。将干细胞悬液与透明质酸钠(山东博士伦福瑞达制药有限公司生产)以1:1的浓度混匀备用。将移植物和肌腱线在干细胞悬液中浸泡30 min;按每点0.1 ml多点均匀注入移植物内，再用肌腱线对移植物体部进行编织，最后在移植物表面均匀喷涂干细胞悬液与透明质酸钠混合物，透明质酸钠会逐渐固化附着于移植物表面，然后在工作台上进行预张，备用。

2.3 手术方法 采用硬膜外麻醉或全身麻醉，患者仰卧位，患肢下垂，健侧下肢放在支腿架上，患肢大腿根部扎气囊止血带。常规消毒铺单，前外侧入路进镜，关节镜下常规探查ACL、后交叉韧带、半月板和软骨损伤情况。采用前内侧入路，处理合并伤，半月板损伤视情况行全切或次全切成型术，软骨损伤者行软骨成型术，用篮钳及刨削器清除原 ACL及滑膜。

首先制备胫骨隧道:将胫骨导向器固定于55°位置上，经髌下内侧入口置入关节腔。将瞄准点定于原韧带胫骨残端中心位置，使胫骨隧道外口中心距关节面约3 cm。沿导向器钻入1根2 mm导针，分别用空心钻头和套筒钻作直径20 mm隧道，保留所获松质骨供胫骨隧道植骨用。最后修整打磨隧道以适应移植物胫骨附着点的解剖外形。后制备股骨隧道:膝关节屈曲45°，推开后侧骨皮质的骨膜，通过胫骨隧道放入股骨导向器。再继续屈膝至60～90°，检查胫骨隧道后缘是否有碰撞。沿导向器钻入1根2 mm导针。用空心钻头经导针在股骨钻孔，直径20 mm，深1.5 cm。刮匙和伞形刨削器打磨修整隧道，以适应移植物股骨附着解剖外形。保持屈膝60°～90°，从胫骨隧道置入带槽导针，导针在隧道内的位置偏于胫骨隧道前内侧，并钻穿股骨穿出皮肤。将股骨端肌腱线系于带槽导针尾孔中，牵拉带槽导针，从大腿侧皮肤拉出，使移植物通过胫骨和股骨隧道。

在关节镜下用大小合适的生物界面可吸收螺钉挤压骨块固定;后在关节屈曲30°～40°位，后压胫骨结节，拉紧胫骨端骨块牵引线，再根据患者骨质情况选用1枚与胫骨隧道直径相同或大1 mm的生物界面螺钉固定胫骨侧骨块。将剩余干细胞悬液与透明质酸钠混液在关节镜下注入股骨与胫骨隧道内。再次检查重建ACL的位置、张力和固定稳定性以及与髁间窝有无撞击。最后冲洗关节腔，缝合切口。对照组在术中使用透明质酸钠时不混入干细胞悬液;其余处理均与实验组相同，以保证两组数据在逻辑上具有可比性。

2.4 术后处理 术后卧床1 d，静脉注射抗生素3～5 d。麻醉清醒后即进行股四头肌等长收缩，踝关节背伸、跖屈及直腿抬高锻炼。术后第2天开始患膝CMP锻炼(0°～90°)1 h，2次/d。术后2周拆线，可拄双拐在支具保护下部分负重。3～4周内膝关节活动控制在10°～90°，5～6周时增至0°～110°，7～8周接近正常，开始过伸及下蹲训练。术后12周去拐仅在支具保护下行走，强化股四头肌肌力、关节活动度锻炼。6个月内支具保护并严禁重体力活动。术后12个月内避免患膝剧烈剪切、旋转运动。

2.5 膝关节功能评估

2.5.1 理学查体标准 膝关节活动度(ROM)测量方法:做滑板运动的动作，即患者靠近滑板墙仰卧，臀部距离滑板墙约一脚的长度，双下肢分别放于滑板墙上缓慢向下滑动，直至双下肢各自都不可以继续下滑。此时，用关节活动度测量仪分别测量健侧膝和患侧膝的最大下滑角度，计算健侧及患侧关节活动范围之差(见表3)。

表1 两组患者术前及术后各时间点IKDC评分

表2 两组患者术前及术后各时间点LYSHOLM评分

表3 两组患者术前及术后健侧与患侧膝关节活动范围之差(健侧-患侧)

2.5.2 患者主观感觉指标 包括IKDC评分及Lysholm膝关节评分表(包括跛行、负重、绞锁、关节不稳定疼痛、肿胀、爬楼梯、下蹲，满分100分)。

2.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料采用了均数±标准差表示，实验组与对照组内部手术前后的评分运用重复测量方差分析，两两比较采用SNK检验;组间采用独立样本t检验。检验水准设为α=0.05。

3 结果

两组患者术后均恢复良好，刀口均Ⅰ期愈合，未发生骨折、感染、关节积血、血栓形成等并发症，且均未出现免疫排斥反应。实验组31位患者中有3例失访，对照组26位患者中2位失访，即共52位患者获得全程随访(现仍在随访中)，本文截取每位患者12个月的随访情况进行论述。两组术后各个时间点的IKDC及Lysholm评分、关节活动度均明显优于术前评测情况(P＜0.01)。在术后3个月、术后6个月及术后12个月时实验组与对照组患者的IKDC及Lysholm评分均出现较明显的统计学差异，但是从数据上还显示这种差异在逐渐缩小而非增加。两组患者健肢与患肢膝关节活动度之差在术后3个月、术后6个月时显示出统计学差异，但这种差异在术后12个月消失了。

4 讨论

目前ACL重建的手术方法主要有自体或同种异体腱性组织移植以及人工材料等。自体组织移植难以满足临床需要，且存在供区并发症。人工韧带由于没有较好地解决疲劳断裂和强度衰减问题，其应用受限。现认为，理想的韧带供体移植条件应包括［1］:①容易获取，有足够的直径和长度。②生物学特性与欲替代的韧带相似。③获取后不影响正常的组织结构。④能够保留和提供新的血供。近年来，由于同种异体深低温冻存移植物重建膝关节 ACL有操作简便、创伤小、可避免自体肌腱移植术后出现的一系列供区并发症等优点，故其在临床上的应用逐渐增多。

尽管自体与同种异体移植物的组织学与生物力学特性各有不同，但目前认为，无论应用哪种移植物其在关节腔内的组织学演化过程相同，都要经过移植物的坏死、再血管化、细胞增殖和胶原纤维重建4个阶段，通过爬行替代达到移植物的“复活”［2］。无论是自体还是同种异体的移植物，都只是起到支架作用。虽然同种异体肌腱重建ACL可以得到良好的效果，但有几个先天矛盾的问题是我们无法逾越的:一般为了去除异体移植物的抗原性和防止感染，现在最好的做法就是深低温冻干法和钴60γ射线照射法，上述方法难以避免的会对移植物的生物力学强度产生负面影响，灾难性后果就是移植物在术后发生断裂，文献报道［3］同种异体肌腱移植术后再断裂的发生率为6.5% ～15%，明显高于自体肌腱移植(0～4.8%)。早期生物力学强度不足是同种异体肌腱移植再断裂的重要原因，同时同种异体移植物血管化和塑形速度较自体移植物慢是再断裂的另一个重要因素。由于自身组织长入需要一段时间，在这段时间内移植物必须保持一定的张力，才能保证形成的韧带有力学功能。如何使这个替代过程尽可能在较短时间内完成是手术成败的关键所在。在现阶段要求患者延迟负重与参加体育运动的时间成为临床医师和患者的无奈之举。因此，促进同种异体肌腱移植物尽快“浴火重生”，加速实现胶原纤维的重建，成为该领域的研究热点。

近年来随着细胞工程和组织化学等技术的发展使得细胞移植成为了可能。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类具有很强的自我复制和多向分化潜能的干细胞，研究证实［4］，体内外微环境及各种活性细胞因子的作用下，同样可以向多个细胞系分化，如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱及其他结缔组织。肌腱和韧带一样都是特殊形态发生变化的成纤维细胞，该细胞在创伤组织修复过程中起到很大作用。学者North等证实BMSCs可向韧带样成纤维细胞分化。Watanabe等将转基因小鼠的骨髓间充质干细胞移植入野生型小鼠的侧交叉韧带处，注入的细胞数为1×106，28 d后应用原位杂交方法发现，植入的细胞分化为韧带成纤维细胞。

另外，BMSCs移植可以促进血管新生在诸多研究中已经得到证实，BMSCs移植可以增加缺血脏器的毛细血管密度，改善缺血器官血流量，目前认为其主要机理可能是 :① BMSCs在局部微环境诱导下，向内皮谱系定向分化，自身形成新生血管，增加缺血区血管数量。但是有研究通过用乳酸乙醇酸支架组合成骨样细胞与BMSC比较成血管能力时发现，虽含小鼠支架材料的血管密度较空白对照组明显增多，但成骨样细胞组与BMSCs组分泌的血管内皮生长因子(VEGF)水平相差无几，血管密度基本一致，且成骨样细胞是BMSC分化后的细胞，故认为BMSC促进血管再生细胞旁分泌成血管因子是主要作用，与分化的方向相关性不大。② 被移植的BMSCs通过旁分泌(paracrine)的形式分泌血管生成诱导因子和调制内皮细胞迁移的蛋白质，诱导原先存在的血管内皮细胞激活、增殖、迁移、出芽、搭桥，形成新的毛细血管丛，原有的血窦扩张、伸展，血管重塑。其中BMSCs在缺氧环境和二价金属离子途径等诱导下产生的VEGF被认为是其促进血管再生的主要细胞因子。

ACL的内部结构与一般的肌腱和韧带不同，它除了具备致密结缔组织的特性外，还有一个重要的特性就是具有一定的纤维软骨特性。ACL经组织化学甲苯胺蓝染色呈现异染阳性已被既往学者所证实，因此其刚性应大于一般的韧带或肌腱组织。它的这种类软骨特性在缓冲外力方面发挥着重要作用。当应用异体移植物进行重建时，如果新形成的组织不具备类软骨的特性，必然会影响膝关节的运动功能。因此，可以把完成胶原纤维重建的移植物是否具有类软骨特性作为组织成熟的标志之一。在本研究中将具有多向分化能力的BMSCs移植到移植物表面，除了促进成纤维细胞生长、加快移植物塑形改造过程外，考虑应该还有促进移植物体部向具有类软骨特性方向改造的作用。

另外，本研究采用的是同种异体骨-髌腱-骨作为移植物，所以在愈合过程中并不存在腱-骨愈合的因素。但是我们在手术过程中同样对止点进行了干细胞移植。其思路在于，虽然本研究采用了带骨块移植物固定的金标准-挤压螺钉(挤压理论)，这虽然可以提供坚固的孔内挤压，增加膝关节稳定性和移植物的等长，避免移植物-骨道的运动，但作为异物骨块，其实这完全就是用植骨治疗骨缺损的翻版。研究人员将兔骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合后植入人为制造的股骨骨缺损中，结果发现仅12周植入体与骨缺损处即骨性愈合，明显见新生骨生成，骨缺损能够完全修复，而单纯植入壳聚糖的对照组骨缺损处仅部分修复，且部分骨皮质不连续。说明骨髓间充质干细胞移植能够促进骨缺损的尽快骨性愈合。

在本研究中，我们选择了廉价易得且容易操控固化时间的透明质酸钠作为干细胞的载体。一般认为理想的细胞载体应具备以下特点:①良好的生物相容性及降解性。②骨传导性及诱导性。③满意的机械强度。④可塑形性。⑤可与其他活性分子复合共同诱导骨发生。⑥支持细胞生长和功能分化的表面化学性质与微结构。透明质酸钠作为广泛存在于人体内的生理活性物质，是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基己糖组成双糖单位聚合而成的一种高分子黏多糖。我们用其作为干细胞的载体，主要是因为本品系生物可降解性高分子聚糖类生物材料制成的高浓度凝胶，无菌、无热原、无抗原性及致炎性，具有良好的生物相容性及生物学活性，其所形成的高分子网状结构具有特有的流变学特性。一般6周左右透明质酸钠即可完全吸收降解，细胞也已实现了增殖和粘附。另外，我们还出于另外一种考虑而采用透明质酸钠作为BMSCs的载体。经体外诱导分化构建的软骨细胞移植物一旦脱离严格控制的体外培养环境进入关节腔内，能否适应关节腔内的理化成分，国内外仍无文献报道。但研究同样发现BMSCs在外源性透明质酸钠中生长状况良好，由于关节液中同样存在透明质酸成分，因此我们用透明质酸钠作为缓冲，防止细胞过早暴露于关节液中，但在一定程度上又算是对关节液环境的提前适应。

［1］Siebold R，Buelow JU，BosL，et al.Primary ACL reconstruction with fresh-frozen patellar versus achilles tendon allografts.ArchOrthop Trauma Surg，2003，4:180-185.

［2］Lawhorn KW，Howell SM.Scientific justification and technique for anterior cruciate ligament reconstruction using autogenous and allogeneic soft-tissue grafts.Orthop Clin NorthAm，2003，1:19-30.

［3］Chang SK，EgamiDK，ShaiebMD，et al.Anterior cruciate ligament reconstruction:allograft versus autograft.Arthroscopy，2003，19:453-462.

［4］Abdallah BM，Kassem M.Human mesenchymal stem cells:from basic biologytoclinicalapplications. GeneTher，2008，2:109-116.