二仙汤加味对去卵巢大鼠心肌NF-κBp50、IκBα 的影响

韩为华 乔黎焱 刘镘利 张丽萍 张志红 马 静△

1第四军医大学（陕西西安 710032）

2第四军医大学西京医院（陕西西安 710032）

二仙汤加味对去卵巢大鼠心肌NF-κBp50、IκBα 的影响

韩为华1乔黎焱1刘镘利1张丽萍1张志红2马 静1△

1第四军医大学（陕西西安 710032）

2第四军医大学西京医院（陕西西安 710032）

目的 探寻二仙汤加味对去卵巢大鼠心肌保护作用的机制。方法采用5月龄雌性大鼠建立去卵巢模型，随机分为空白对照组、模型组、加味二仙汤高、中、低剂量组、替勃龙组，每组8只。二仙汤组分别用二仙汤30、15、7.5g/kg生药剂量给药，替勃龙组用0.25mg/kg给药，其余两组给予3mL生理盐水灌胃，各组持续灌胃60d。采用免疫组化法分析心肌NF-κBp50、IκBα的表达。结果模型组与各治疗组、空白组比较，NF-κBp50、IκBα的表达均显著增高。二仙汤各剂量组与模型组比较，NF-κBp50、IκBα表达明显降低。二仙汤组对心肌NF-κBp50、IκBα改善优于替勃龙组。结论去卵巢大鼠心肌中存在NF-κBp50、IκBα的激活，加味二仙汤对其有一定抑制作用，可能是二仙汤心肌保护作用机制之一。

加味二仙汤 去卵巢 心肌细胞 NF-κBp50 IκBα

△通信作者

研究证实，女性绝经前保持在一定水平的雌激素对心血管系统有一定的保护作用。随着绝经后卵巢功能的衰退，体内雌激素水平下降，血脂代谢异常，血黏稠度增加，从而导致动脉硬化、冠心病的发病率显著增加，因此，绝经后冠心病机制的研究得到了广泛重视。随着研究的深入，核转录因子NF-κBp50及其抑制蛋白IκBα在绝经后冠心病发病机制中的作用备受关注。本研究采用细胞免疫组化法评价加味二仙汤对去卵巢大鼠心肌NF-κBp50、IκBα表达的影响，探讨该方对心肌的保护机制.

1 实验材料

1.1 动物 5月龄雌性SD大鼠48只，清洁级，体质量（300±10）g，由第四军医大学实验动物中心提供。

1.2 药物 二仙汤加味组成：仙茅9g，淫羊藿9g，知母6g，黄柏6g，巴戟天 9g，当归 9g，香附 6g，葛根 15g，远志 6g。 中药由西京医院中药房提供，常规煎煮，浓缩为所需浓度中药混悬液，含生药3.0g/mL。替勃龙片 （南京欧加农制药有限公司），稀释为0.025mg/mL混悬液。以上药液4℃冰箱保存备用。

1.3 试剂及仪器 NF-κBp50单克隆抗体及试剂盒：美国SantaCruz公司，武汉博士德生物技术有限公司生产；超薄切片机：德国Rechert-Jung公司；TDR-9070A恒温干燥箱：陕西天美科学仪器有限公司；Motic Med 6.0 CMIAS系列数码医学图像分析系统，麦克奥迪公司（中国厦门）生产；DAB显色试剂；倒置显微镜。

1.4 分组与造模 将48只大鼠随机分为6组：空白对照组、模型组、二仙汤高、中、低剂量组，替勃龙组，每组8只。大鼠经2%戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉后，摘除卵巢，术后第5日开始，连续5d阴道涂片，每日1次，证明去势彻底。

1.5 药物干预 造模成功10d进行药物干预，二仙汤高、中、低剂量组分别用二仙汤30、15、7.5g/kg剂量给药，替勃龙组用0.25mg/kg给药，其余组给予生理盐水3mL灌胃，各组持续灌胃60d。

1.6 标本采集与检测 灌胃结束第2日，将大鼠以2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，迅速剪开胸腔取心尖部组织，置于4%多聚甲醛溶液固定12h。 ①石蜡切片脱蜡、水化。②3%过氧化氢孵育5min，以阻断内源性过氧化物酶。③将切片放入盛有EDTA抗原修复液中，置微波炉中加热至95℃以上并持续10min，室温下自然冷却，修复抗原。④滴加工作浓度1∶100的特异性抗体NF-κBp50/IκBα覆盖组织切片，置于湿盒内4℃过夜。PBS冲洗2min×3。⑤滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃，20min，PBS冲洗，2min×3。⑥应用DAB溶液显色。⑦蒸馏水冲洗、苏木素复染、脱水、封片。采用CM IAS系列多功能真彩色病理图分析系统对免疫组织学图像进行分析，阳性细胞肌浆呈棕黄色表达。放大200倍，每张标本随机输入5个视野，取平均值，结果以面密度表示。

2 结 果

模型组心肌NF-κBp50、IκBα阳性表达均明显高于其他组（P＜0.05），说明去卵巢能激活 NF-κBp50、IκBα 反应链，增加细胞因子 NF-κBp50、IκBα 的分解，并且激活 NF-κBp50 进入细胞核启动相关靶基因转录。同模型组比较，二仙汤各剂量组NF-κBp50表达均明显减弱 （P＜0.05），其中高剂量组降低最为明显，说明加味二仙汤各剂量均可抑制止NF-κBp50分解以及NF-kBp50激活，且疗效优于替勃龙组（P＜0.05）。

表1 各组去卵巢大鼠心肌 NF-κBp50、IκBα 表达比较 （±s）

表1 各组去卵巢大鼠心肌 NF-κBp50、IκBα 表达比较 （±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与替勃龙组比较，△P＜0.05。

组 别 n NF-κBp50（×10-2）空白对照组 8 5.41±1.62*模型组 7 16.54±2.48替勃龙组 7 13.21±1.74*IκBα（×10-2）4.38±0.52*16.21±1.55 14.26±0.53*二仙汤高剂量组 8 9.43±0.61*△ 10.34±0.17*二仙汤中剂量组 6 10.43±2.28* 12.17±0.85*二仙汤低剂量组 8 12.03±0.47*13.46±0.61*

3 讨 论

中医认为，女性绝经后冠心病的发病机理是由于阳气不足，鼓动无力，血行不畅、瘀阻心脉所致，属于本虚标实之证。而且女性绝经后卵巢功能减退，雌激素水平下降的生理特性与女子七七，肾气虚衰、阴阳失调的病变基础存在一定关系。因此，治疗应侧重从肾论治，以补肾通脉为纲，以益气活血为基本治法，调整阴阳、调和冲任气血[1]。加味二仙汤正是针对这一病机设立的有效方剂，是运用补益肾精、益气活血之大法治疗绝经后冠心病临床疗效显著。

绝经后，随着雌激素水平的不断下降，机体脂质代谢异常，血黏稠度增加，导致动脉粥样硬化、冠心病的发病率明显上升。大量证据证实冠心病与机体的炎症过程存在一定相关性[2-3]。炎性反应的分子基础与NF-κBp50因子的异常表达相关。NF-κBp50是一种重要的核转录因子，当NFκB被激活并进入细胞核，与多种细胞基因启动子或增强子序列位点发生特异性结合而引起一系列因子表达的增加，如内皮素-1（ET-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、白介素-1B（IL-1B ）、白介素-6（IL-6）等[4]。通过炎症介质瀑布样级链效应，引起心肌缺血再灌注损伤明显增加以及冠脉血管内皮细胞功能严重损害，可见在心肌损伤炎症发生发展中NF-κBp50的介导扮演着重要的角色[5]。

总之，NFκBp50（IκBα）-IL-1B 重要的基因调控环节在绝经后冠心病的发生、发展中起着重要作用[6]。其不仅增强了局部炎症反应，而且发挥了转录调控靶基因的作用，即细胞的许多信号传导途径必须涉及到NFKB改变才体现出相应的效应。因此，在这一通路中任何一个环节细胞因子表达的增加，都会在绝经后冠心病的发病中发生级联反应，导致病变的加重；而阻断这一途径的任何一个环节，可以切断这一通路上游刺激物与下游靶基因的病理性联系，起到预防病变的发生或中止病变的发展的作用。

本研究证实，加味二仙汤能降低NF-κBp50核因子及其抑制蛋白 IκBα的表达，我们认为该药正是通过阻断 NFκBp50（IκBα）-IL-1B这一通路，中断了上游刺激物与下游靶基因病理性的联系，进而干预了相关基因的转录调控，阻止了对心血管的严重损害来发挥其心肌保护的治疗作用。所以说，抑制NFκBp50（IκBα）因子的表达，可能是加味二仙汤心肌保护作用的重要机制之一。

[1]张云鹏，徐瑛，余恒先.冠心病中医辨治述要[J].上海中医药大学学报，2009，23（3）：1-2.

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[4]艾艳秋，谢小娟，张卫盐酸戊乙奎醚对心脏瓣膜置换术患者心肌细胞NF 2κB活性及血浆TNF 2α水平的影响[J].郑州大学学报，2009，44（5）：996-997

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R285.5

A

1004-745X（2011）09-1440-02

2011-04-05）