芎芍胶囊对心肌梗死大鼠缺血心肌mRNA表达水平的影响*

严 萍 林久茂 陈宇宁 赵锦燕

庄群川2 陈美华1 叶 盈2 黄飞翔1

1福建省中医药大学附属第二人民医院（福建福州 350003）

2福建省中西医结合研究院（福建福州 350003）

芎芍胶囊对心肌梗死大鼠缺血心肌mRNA表达水平的影响*

严 萍1△林久茂2陈宇宁1赵锦燕2

庄群川2陈美华1叶 盈2黄飞翔1

1福建省中医药大学附属第二人民医院（福建福州 350003）

2福建省中西医结合研究院（福建福州 350003）

目的 用RT－PCR检测中成药芎芍胶囊对心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生作用。方法采用开胸结扎冠状动脉左前降支的方法建立心肌梗死模型，SD大鼠分为模型对照组和芎芍胶囊高、中、低剂量组，灌胃给药，连续给药6周；RT－PCR法检测缺血心肌EGF、VEGF、TGF-β1、PDGF-A、PDGF-BB等促血管生成因子的表达。结果其中芎芍胶囊低、中、高剂量组VEGF、EGF与模型对照组比较均有统计学意义，高剂量组对VEGF的促进作用较中、低剂量组有统计学意义，中剂量组对EGF的促进作用较高、低剂量组有统计学意义，对照组对TGF、PDGF促进作用较高、中、低剂量组有统计学意义。结论芎芍胶囊具有促进心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生、提高心肌梗死大鼠心肌细胞VEGF、FGF、EGF蛋白的表达、具有保护心肌缺血性损伤的作用。

芎芍胶囊 心肌梗死 血管新生 RT-PCR

芎芍胶囊由川芎、赤芍组成，是取其有效作用部位川芎总酚和赤芍总苷制成，具有活血化瘀、通脉止痛的功效。本实验应用芎芍胶囊在心肌梗死大鼠上观察缺血心肌血管新生的影响，并通过用RT－PCR法检测心肌组织中表皮细胞生长因子（EGF）、内皮细胞生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF）、血小板源生长因子（PDGF）等促血管生成因子的表达，初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物 芎芍胶囊（北京西苑医院，批号：Z20053499），按成人临床用量的10倍、5倍及相等剂量配制成高、中、低3种剂量，浓缩至所需的浓度，于4℃保存待用。

1.2 实验动物 清洁级SD雄性大鼠32只，体质量250～280g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供 [许可证号SCXK（沪）2007-2005]。

1.3 主要仪器 显微镜：日本奥林巴斯 BX51T-PHD-J11；CMOS：日本奥林巴斯。多功能真彩色细胞图象分析管理系统：美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus。切片机：德国莱卡RM2015。Trizol试剂盒等。

1.3 模型复制 分批对大鼠腹腔注射氯胺酮和安定复合麻醉后，取仰卧位，术区备皮消毒，气管插管，呼吸机辅助通气（300mL/min）。取第2肋间水平横切口，剪断胸骨，切开心包，暴露主动脉根部，钳夹左前降支动脉暂时阻断血流30min后，松开钳夹的左前降支动脉，压迫穿刺口止血，关胸复苏。为防止术后感染，每日肌注青霉素40万U/只，连续3d。

1.4 分组与给药 清洁级 （或SPF级）SD大鼠32只 （雌雄各半）分为4组（即高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型对照组），每组8只，芎芍胶囊按成人临床用量的10倍、5倍及相等剂量配制成高、中、低3种剂量浓缩至所需的浓度，进行灌胃给药，模型对照组给予等量生理盐水灌胃，连续给药6周后取新鲜冻存心肌组织80mg备用。

1.5 RT-PCR 取总RNA 1μg，应用逆转录（RT）试剂盒进行逆转录反应。 PCR 反应体系 （20μL 体系）：cDNA 1μL，10×Taq Buffer（含 Mg2+） 1.5μL，10mM dNTP 0.2μL，5U/μL Taq 酶 0.2μL，上下游引物各0.3μL，加DEPC水至20μL，震荡混匀，置PCR仪扩增，扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性40s，退火40s，72℃延伸 45s；72℃终末延伸 10min，35个循环。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶成像分析系统中扫描分析条带。选用b-actin为内参照基因。PCR引物见表1。

表1 EGF、EGFR和 -actin基因的特异性引物

1.6 统计学处理 用STATA 16.0统计软件。定量数据首先进行方差齐性检验，方差不齐者对原始数据对数转换达到方差齐性后进行F检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

芎芍胶囊均不同程度促进VEGF、FGF、EGF的分泌，与模型对照组比较均有统计学意义（P＜0.05）；高剂量组对FGF的促进作用较中、低剂量组有统计学意义 （P＜0.05）；中剂量组对EGF的促进作用较高、低剂量组有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组对PDGF-BB促进作用较高、低剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）；模型对照组对 TGF、PDGF-A 促进作用较高、中、低剂量组有统计学意义（P＜0.05）。见图1、图2。

3 讨 论

VEGF、FGF、EGF、TGF、PDGF 都是具有促血管新生作用的生长因子。血管生长因子可以通过刺激内皮细胞生长和迁移，诱导、促进血管新生，促进其相关组织的生长和修复。其主要机制包括：促进心肌和周围血管新生；促进粥样硬化斑块再内皮化；促进心肌梗死组织愈合；促进血栓再通；通过改善微血管功能失调治疗充血性心功能失调[1]。

图1 不同因子PCR产物电泳条带图

图2 各组大鼠心肌 TGF，FGF，VEGF，EGF，PDGF-A，PDGF-B mRNA表达图

本研究显示，芎芍胶囊组对 VEGF、FGF、EGF、PDGF-BB 与对照组比较有明显的促进作用，对照组对TGF、PDGF-A促进作用较芎芍胶囊好，可能的原因：（1）TGF在冠状动脉粥样硬化形成过程中是双向调控因子，一方面能缓解损伤反应，保护细胞、促进修复，抑制粥样斑块的形成，另一方面又引起细胞外基质的过度沉积、组织纤维化、参与再狭窄、血管和心肌重塑等系列的病理变化[2]。 （2）PDGF不仅产生于血小板，亦可来源于平滑肌，内皮细胞和单核巨噬细胞。PDGF有3种异构体：PDGF-AA、PDGF-AB和 PDGF-BB[1]，它们具有强大的促 VSMCs增殖和向内膜下迁移的作用。在血管损伤早期主要来自血小板α颗粒，增生VSMCs释放的PDGF可能在内膜增生晚期更为重要，球囊损伤后，培养的内膜VSMCs的PDGF样活性物质分泌增加，PDGF-B受体和PDGF-A键mRNA表达亦增加，将PDGF-A和PDGF-B两种不同的表达载体导入猪的髂动脉，发现PDGF-B可以促进内膜的增生和VSMCs向内膜下迁移，而PDGF-A无此作用。应用PDGF-A或PDGF-B的抗体，发现只有PDGF-B抗体可以阻止和抑制内膜下增生，提示在内膜损伤和再狭窄的形成中，PDGF-BB可能是主要成分，对PDGF效果差是否因各种生长因子出现的时间是否是不同步有关；Cercek发现，球囊损伤后PDGF-B键mRNA表达在头3天增加2倍，第7天达高峰，2周恢复基础状态[3]。芎芍胶囊观察6周，是否与时间有关。

本研究表明，芎芍胶囊具有促进心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生、提高心肌梗死大鼠心肌细胞VEGF、FGF、EGF蛋白的表达、具有保护心肌缺血性损伤的作用。但有关机制仍有待进一步研究。

[1]吴永全，袁良，胡大一.生长因子在PTCA术后再狭窄形成中的作用[J].国外医学：心血管疾病分册，1999，26（2）：75-77.

[2]张文宗，林钟香.转化生长因子-β1在冠心病中的研究进展[J].实用医学杂志，2008，24（21）：3779-3781.

Effect ofXiongshao Capsuleon mRNA Expression in Myocardial Ischemia of Rats with Myocardial Infarction

YAN Ping1，LIN Jiu-mao2，CHEN Yun-ning1，et al
1TheSecondPeople'sHospitalAffiliatedtoFujianUniversityofTraditionalChineseMedicine（Fuzhou350003，Fujian）
2Academy of Integrative Medicine，Fujian Province（Fuzhou350003，Fujian）

Objective：To detect the myocardial neovascularization effect of theXiongshao Capsuleon myocardial ischemia rats.Methods：The myocardial ischemia model was established by ligating the left anterior descending branch of the coronary artery.These SD rats were divided into the model control group，theXiongshao Capsulehigh dose group，theXiongshao Capsulemiddle dose group and theXiongshao Capsulelow dose group.After 6 weeks，the angiogenic factors in the angiogenesis such as EGF，VEGF，TGF-β1，PDGF-A and PDGF-BB.Results：There were some statistical differences in the VEGF，EGF，TGF and PDGF among 3Xiongshao Capsulegroups and the control group.Meanwhile，compared with the middle dose group and the low dose group，the increase of the high dose group was more significant in the VEGF.Compared with the high dose group and low dose group，the improvement of middle group was more obvious in EGF.Conclusion：Xiongshao capsulecan improve the myocardial neovascularization and increase some proteins expressions including VEGF，FGF and EGF.It has the effect of myocardial ischemia injury.

Xiongshao Capsule；Myocardial ischemia；Myocardial neovascularization；RT-PCR

R285.5

A

1004-745X（2011）09-1426-02

陈可冀中西医结合发展基金资助项目（CKJ2008043 2008J1004-06）

△通信作者

2011-04-12）