福建早熟柔嫩艾美耳球虫的选育研究

吴昌标 林 平 郑文金

（1.福建农业职业技术学院，福州 350119；

2.福建农林大学，福州 350002；

3.福清市文华实业有限公司，福清 350303；

4.莆田市金日兴生物科技有限公司，莆田 351100）

1 引言

鸡球虫病（Avian coccidiosis）是集约化养鸡业多发、危害严重且防治困难的寄生虫病之一，造成的经济损失十分巨大[1-2]。据统计，包括防治该病所花的药费在内，全球每年损失约80亿美元[3]。在我国，每年花在球虫病预防方面的费用达到10～20亿元人民币，成为现代化集约式家禽养殖业中最耗资的疾病。

传统上，防治鸡球虫病主要采取饲料中添加化学药物的方法，这些药物可以阻断球虫生活史从而达到控制球虫病的目的[4]。虽然持续化学药物添加已被证明对集约化鸡场防治球虫病有很高的效果[5-6]，然而化学药物在治疗鸡球虫病的同时对动物机体有不同程度的副作用，且在动物机体内有不同程度的残留，危害人类健康、污染环境[7]。用疫苗控制球虫病和药物防治相比，不仅经济、有效，节省劳动力，生产性能好，而且可以最大限度满足消费者对绿色食品的关注，已成为防治鸡球虫病较好的技术手段[4]。国内外一些单位开展了鸡球虫病免疫预防研究，取得了一定的成效，如中国农业大学、广西大学和新疆农业大学等单位相继通过鸡球虫早熟系等方法的选育获得了免疫原性好、致病性低的球虫虫株，用于鸡球虫病的免疫预防，获得了良好的效果[8-9]。

为了探索福建省莆田市鸡球虫病免疫预防的方法，选育本地的球虫株，本课题组应用球虫单卵囊分离技术分离鸡柔嫩艾美耳球虫莆田株，在此基础上传代选育其早熟系，并对其生物学特性进行研究，为福建省莆田市鸡球虫病的免疫预防奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

1日龄爱拔益加（Arbor Acres，AA）肉鸡，购自莆田温氏家禽有限公司，饲养于严格消毒的无球虫舍内，自由采食和饮水。

1.2 试验饲料

由莆田市金日兴生物科技开发有限公司按本实验小鸡营养需要单独配制，不添加任何抗生素和其他抗球虫药物。

1.3 试验卵囊

1.3.1 卵囊收集

从福建省莆田市某鸡场采集患有柔嫩艾美耳球虫病的病死鸡，刮取盲肠内容物及黏膜，置于研钵内研磨，加水搅拌、过滤。将滤液以3 000 r/min离心沉淀10 min，弃上清液，沉淀物中加饱和盐水，充分搅拌混匀后3 000 r/min离心漂浮10 min，取上层液，加入约10倍量水，充分混匀后3 000 r/min离心沉淀10 min，弃上清，沉淀中加入2.5%重铬酸钾溶液并移入平皿中，置26～27oC恒温培养箱孢子化。孢子化期间，保持溶液深度不超过2 cm，每天用吸管反复吹打3～4次，至80%以上卵囊孢子化时为止。孢子化后的卵囊液置4oC冰箱中保存备用。

1.3.2 单卵囊分离

取冰箱中保存的孢子化卵囊悬液，2 000 r/min离心10 min，弃上清，以同样的速度和时间离心3～4次，用生理盐水洗去重铬酸钾，然后加饱和食盐水漂浮，用牙签沾取悬液，点在琼脂块上，在显微镜下观察。确认1个琼脂块只有1个卵囊，而且卵囊中有8个子孢子时，将含单个卵囊琼脂块经口喂给4日龄无球虫雏鸡。感染后5 d逐只查粪便，发现卵囊即为单卵囊后代，收集并孢子化。

用单卵囊繁殖的后代，接种无球虫雏鸡进行增殖，同时观察在肠道寄生部位、病变特征。显微镜下观察增殖后的卵囊形状、颜色、大小等特征。用测微器随机测量100个孢子化卵囊，孢子囊大小，计算卵囊形态指数。

1.3.3 虫株纯化增殖

将单卵囊分离技术分离纯化得到的卵囊，经口感染小鸡20只，收集增殖的卵囊，在2.5%的重铬酸钾溶液培养至孢子化后，置40C冰箱中保存。

1.4 早熟株选育

1.4.1 亲代虫株确定

将分离、鉴定、增殖的纯化卵囊确定为亲代虫株，用于早熟系的选育、繁殖力和致病力的研究。

1.4.2 繁殖力测定

亲代虫株卵囊每1个半月感染复壮1次。复壮后的亲代卵囊与最近1代选出的早熟系（第6代）卵囊分别感染2周龄小鸡10只，接种量为孢子化卵囊60个，感染96 h后，连续3 d分别收集、计数两组小鸡粪便排出的卵囊数量，计算方法按McMaster法[10]。

1.4.3 致病力检测

试验设复壮后的亲代卵囊组、最近一代选出的早熟系（第6代）卵囊组及不感染对照组，感染剂量为5×104个/只。感染当天早晨试验用14日龄小鸡逐只空腹称重，淘汰弱雏及体质量过大者，编号。然后根据体质量离散度随机分组，每组30只。感染后1周结束试验，以各试验组的临床表现、平均增重、相对增重率、死亡率和病变计分等为致病力指标[11]。

2 结果与分析

2.1 单卵囊分离结果

将用单卵囊分离获得的20个单卵囊分别感染20只1日龄AA鸡，其中7只感染成功，分别收集7只小鸡粪便中的卵囊，并对他们的卵囊的形状、大小进行初步观察和测量后，选择了其中5号小鸡所排的卵囊为亲代虫株卵囊。

2.2 亲代虫株卵囊大小的测量结果

将从5号小鸡中分离出的亲代虫株感染小鸡，收集卵囊获得一定数量的纯化虫株卵囊后，测量增殖得到的卵囊及其孢子化卵囊大小各100个，结果见表1。

表1 亲代卵囊和孢子囊形态和大小

2.3 早熟系选育结果

本次选育实验共传代6次，结果见表2。从试验结果来看，经过6代的早熟选育，第六代虫株的卵囊潜在期比亲代的提前了6 h。

表2 早熟系继代选育结果

2.4 繁殖力测定结果

分别用复壮后的亲代虫株与初选出来的早熟系（即第6代）卵囊感染小鸡，测定二者的繁殖力，结果见表3。从实验结果来看，经过6代的早熟选育，早熟虫株的繁殖力已明显下降，仅为亲代的50.6 %。

表3 繁殖力测定

表4 致病性检测结果

2.5 致病性检测结果

用5×104个/只剂量作感染实验，早熟系和亲代球虫致病结果见表4。从表4可以看出，经6代早熟选育的莆田球虫株仍有一定的致病性，但与亲代球虫相比，二者在死亡率、相对增重率、平均增重和病变计分等指标方面均有较大差异，早熟系的致病性明显减弱。

3 讨论与结论

3.1 单卵囊分离技术

本研究应用单卵囊分离技术从福建省莆田市球虫病鸡粪便排出的卵囊中，成功的分离出了纯种鸡球虫虫株，根据对其卵囊形态（卵囊形态指数1.16）、大小（22.6×19.4）、寄生部位（盲肠）、亲代潜在期（118 h）、卵囊孢子化时间（20 h）和病变特征的分析[11]，可以初步确定从福建省莆田市该鸡场所分离的球虫株为柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）。

3.2 选育柔嫩艾美耳球虫早熟系

柔嫩艾美耳球虫莆田株经6代的早熟选育，孢子化的卵囊有感染性，口服感染后在鸡体内繁殖，形成卵囊随粪便排出体外，重复收集纯化感染后最先排出的卵囊，获得鸡球虫早熟株。早熟虫株卵囊潜在期比亲代虫株提前了6h，获得了具有早熟倾向的虫株。

3.3 早熟系的繁殖力明显下降

球虫的繁殖包括无性繁殖和有性繁殖阶段由于早熟株最后一代裂殖生殖缺陷，导致了其繁殖力的下降。早熟柔嫩艾美耳球虫繁殖力只有亲代的50.6%，明显减弱。

3.4 早熟系的致病性显著降低

综合早熟柔嫩艾美耳球虫和亲代虫株的临床症状、死亡率、相对增重率、平均增重和病变计分的统计分析结果，早熟柔嫩艾美耳球虫致病力减弱。这与国内多个课题组研究结果一致[12-13]，由于早熟株最后一代裂殖生殖不完全，最后一代裂殖生殖快且内含亲本株较少的裂殖子，比亲本提前进入配子生殖，裂殖生殖世代的减少，对肠道上皮细胞的破坏力下降而使其毒性显著降低。

早熟性状是由基因决定的，甚为稳定，一般不存在毒力回复突变的可能[14]。本研究选育的柔嫩艾美耳球虫早熟系稳定性好，繁殖力下降、致病性减弱，可以进一步进行免疫原性的研究，以便用于鸡的免疫，预防鸡的球虫病。

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