巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对8种抗球虫药的敏感试验

赵其平，李 婷，董 辉，韩红玉，孔春林，姜连连，朱顺海，黄 兵

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241）

鸡球虫病是严重危害养禽业的一种原虫病，每年全球仅抗球虫药花费高达20亿美元。目前，预防该病的最主要方法为药物防治，但事实证明，任何一种抗球虫药在使用一定时间后，都会引起球虫产生抗药性，只是不同类型药物的抗药性产生速度和耐药的程度不同而已[1,2]。因此除了采用联合用药、穿梭用药、轮换用药等方法延缓耐药性的产生外，免疫防治也必将在控制球虫病中占领越来越重要的地位[3,4]。目前，国外已有几种商品化球虫疫苗在推广使用，包括强毒疫苗Coccivac、Immucox和早熟弱毒疫苗Paracox、 Livacox等，在大规模试验和田间试验中表明都具有良好的免疫效力和免疫效果[5]。

本实验室早期对巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫进行了早熟选育，并对其生物学特性进行了研究，结果表明与母株相比，两个早熟株的致病力均明显减弱，且具有良好的免疫原性和遗传稳定性[6,7]。本试验旨在对巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株的药物敏感性进行研究，为球虫早熟株疫苗的研制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物三黄鸡购自上海市郊区某孵化厂，出壳后即运回本所动物房隔离饲养。在无球虫环境下喂养至14日龄，试验前连续2d检查粪便，确认无球虫感染。

1.2 试验虫株巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima）早熟株（资源号CAAS 2111314）和柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）早熟株（资源号CAAS 2111607），均由上海兽医研究所球虫病防治课题组实验室诱导获得，其潜在期分别为107 h和118 h，比母株缩短了35 h和23 h[6,7]。两个虫株在试验前分别接种无球虫鸡繁殖获得所需数量，置于2.5%重铬酸钾溶液孢子化后，4℃冰箱保存备用。

1.3 试验药物威迪，含0.5%地克珠利(Diclazuril)，批号20090418，用量1×10-6；美球，含10%氯苯胍（Robenidine），批号20090423，用量33×10-6；捕球，含6%癸氧喹酯（Decoquinate），批号20090407，用量20×10-6；尼克球，含25%尼卡巴嗪（Nicarbazin），批号20090505，用量125×10-6；禽康，含1%马杜米星（Maduramicin），批号20090609，用量5.0×10-6。以上5种药均由浙江汇能动物药品有限公司生产。肠球安，含25%二 硝 托 胺（Dinitolmide）， 批 号 20090526， 用量125×10-6，广东高山动物药业有限公司生产。美路先，含45%盐霉素 （Salinomycin），批号20090519，用量60×10-6，清远容大生物工程有限公司生产。球安，含15%拉沙洛西（Lasalocid），批号20090423，用量75×10-6，罗氏公司生产。将以上8种药物分别按规定剂量拌入饲料中备用。

1.4 试验方法14日龄时，对雏鸡逐只称重分组，每个虫株设10组：8个用药感染组、1个感染不用药组及1个不感染不用药组，每组16只鸡，每组2个重复。分组后用药组即开始饲喂含药饲料，直至试验结束。用药1 d后（即15日龄），各感染组进行人工感染球虫早熟株，其中巨型艾美耳球虫早熟株感染剂量为10×104个/羽，柔嫩艾美耳球虫早熟株感染剂量为8×104个/羽。感染后5～7 d，每天收集粪便称重，用麦氏虫卵计数法计算每克粪便卵囊数（OPG），统计每天每只鸡排出的卵囊量。感染后7 d，逐只称重、剖杀，取小肠中段或盲肠，按Johnson 等[8]所述方法进行肠道病变记分。试验期间观察记录各组鸡的精神状况、食欲、饮水及粪便状况。

1.5 判定指标与标准参照球虫抗药性判定指标与标准[9]，即选用4项指标综合判定。最适抗球虫活性百分比（percent of optimum anticoccidial activity，POAA），POAA＞50%为阴性，POAA≤50%为阳性。病变记分减少率（reduction of lesion scores，RLS），RLS≥50%为阴性，RLS＜50%为阳性。相对卵囊产量（relative oocyst production，ROP），ROP ＜15%为阴性，ROP≥15 %为阳性。抗球虫指数（anticoccidial index，ACI），ACI≥160为阴性，ACI＜160为阳性。阳性用“＋”表示，阴性用“-”表示。按4项指标中出现阳性指标的数量确定药物敏感性程度，0～1个“＋”为敏感，2个“＋”为轻度敏感，3～4个“＋”为不敏感。

1.6 数据处理方法采用SAS8.0统计软件对各组的相对增重和病变记分进行方差分析，其中P＜0.05为差异具有显著统计学意义，P＜0.01为差异具有非常显著统计学意义。

2 结果

2.1 相对增重率、存活率、病变记分和卵囊量巨型艾美耳球虫早熟株的试验结果见表1。由表可知，所有组均未出现死亡。在增重方面，盐霉素、地克珠利和二硝托胺等组的相对增重率分别为64.83%、72.52%和73.43%，与感染对照组相当，均明显低于健康对照组（P＜0.01）；其余组与健康对照组相当。在病变方面，地克珠利、癸氧喹酯和拉沙洛西等组病变记分为0，其他组都出现不同程度的病变，但都明显低于感染对照组（P＜0.01）。在卵囊产量方面，癸氧喹酯组未见有卵囊排出，其余各组均有少量卵囊排出，但产量远远低于感染对照组。

表1 巨型艾美耳球虫早熟株相对增重率、存活率、病变记分、卵囊量Table 1 Weight gain, survival rate, lesion scores and oocysts production of the precocious line of E.maxima

柔嫩艾美耳球虫早熟株的试验结果见表2。由表可知，感染对照组死亡率为10%，其余各组均未出现死亡情况。在增重方面，盐霉素和二硝托胺等组最差，相对增重率分别仅为51.06%和67.36%，与感染对照相当，均明显低于健康对照组（P＜0.05）。在病变方面，地克珠利、氯苯胍、癸氧喹酯和拉沙洛西等组病变记分为0，其余组出现轻微病变，但明显低于感染对照组（P＜0.05）。在卵囊产量方面，地克珠利、氯苯胍、癸氧喹酯和拉沙洛西等组未有卵囊排出，其余各组均有少量卵囊排出，但产量远远低于感染对照组。

表2 柔嫩艾美耳球虫早熟株相对增重率、存活率、病变记分、卵囊量Table 2 Weight gain, survival rate, lesion scores and oocysts production of the precocious line of E.tenella

2.2 药物敏感性结果 巨型艾美耳球虫早熟株的药物敏感性结果见表3。由表可知，地克珠利、二硝托胺、盐霉素等组的3项指标为阴性，判定为敏感；氯苯胍、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星和拉沙洛西组的4项指标均为阴性，判定为敏感 。

表3 巨型艾美耳球虫早熟株的药物敏感性结果Table 3 Results of drug sensitivity of the precocious line of E.maxima

柔嫩艾美耳球虫早熟株的药物敏感性结果见表4。由表可知，盐霉素组的2项指标为阳性，判定为轻度敏感；地克珠利、氯苯胍、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星和拉沙洛西等组4项指标均为阴性，判定为敏感；二硝托胺组的POAA 1项指标为阳性，也判为敏感。

表4 柔嫩艾美耳球虫早熟株的药物敏感性结果Table 4 Results of drug sensitivity of the precocious line of E.tenella

3 讨论

自20世纪30年代Levine[10]首次发现磺胺类药物对鸡球虫病有疗效以来，国内外已有50余种药物用于防治球虫病，大致分为离子载体类抗球虫药和化学合成类抗球虫药。本试验选用的8种常用的抗球虫药，其中盐霉素、拉沙洛西、马杜米星属于离子载体类抗生素，地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、尼卡巴嗪、癸氧喹酯均属于化学合成药。离子载体类抗生素具有相似的抗球虫作用机制，都能与细胞外的阳性离子（尤其K+、Na+、Ca2+和Mg2+）结合成脂溶性络合物，通过细胞膜上的“膜转运蛋白”不断将阳离子送入细胞内，破坏球虫离子平衡，最终杀死或者抑制球虫[11]。化学合成抗球虫药物种类繁多且作用机制不尽相同，其中氯苯胍可干扰蛋白质的形成，癸氧喹酯可破坏球虫线粒体内细胞色素的传递，而地克株利、二硝托胺和尼卡巴嗪的作用机制至今还不清楚[12,13]。

本试验中，用地克珠利预防巨型艾美耳球虫早熟株感染鸡的增重较差（POAA为阳性），而预防柔嫩艾美耳球虫早熟株感染鸡的增重效果良好，原因可能是该药对不同球虫主要作用峰期有异，而影响鸡的生长发育。据报道，地克珠利对柔嫩艾美耳球虫无性生殖和有性生殖阶段都有作用，对巨型艾美耳球虫主要作用在合子阶段，对裂殖生殖阶段无效，而裂殖生殖是球虫对宿主损失最严重的阶段[14]。扬州市、安徽省等地野外球虫分离株均对二硝托胺产生完全耐药性[15-17]，而本试验中所用的巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫两个早熟株均由实验室早期分离保存的母株诱导而来，对二硝托胺产生耐药性的可能性不大。二硝托胺对两个早熟株感染组的减卵率达94%以上，效果极为显著，但增重偏差，可能是二硝托胺对鸡的生长有一定影响所致。盐霉素是一种对球虫很有效的药物，在人工感染柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊8万/羽的笼饲试验中，盐霉素防治组的相对增重率达88.82%～94.24%[18,19]。在本试验中，盐霉素对巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫两个早熟株感染组，在控制肠道病变和卵囊产量方面均效果显著，但在增重方面却效果不明显，其相对增重率仅为64.83%和51.06%，导致POAA为阳性。造成增重较差的原因可能是盐霉素发生降解，降解产物影响了鸡的生长发育[20]。

本文采用POAA、RLS、ROP和ACI 4项指标，综合检测了巨型艾美耳球虫早熟株和柔嫩艾美耳球虫早熟株对8种常用抗球虫药物的敏感性。结果显示，两个早熟株对地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星、拉沙洛西均敏感，而对盐霉素因增重偏低导致敏感性降低，并分析了二硝托胺、盐霉素引起两个早熟虫株和地克珠利引起巨型艾美耳球虫早熟株感染组增重偏低的原因。研究结果为开发和应用球虫早熟株疫苗积累了实验数据。

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