电针对抑郁模型大鼠海马脑源性神经营养因子基因表达的影响

韩焱晶，李文迅，贾宝辉，时宇静，图 娅△

(1.中国中医科学院针灸研究所，北京 100700;2.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029;3.中国中医科学院广安门医院，北京 100053;4.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养素家族中的主要成员之一，对神经元突触可塑性和神经网络的构建产生重要影响，在抑郁症的发病机制中起着重要作用。本研究通过观察电针对抑郁模型大鼠不同时段行为的影响，明确针刺治疗抑郁症的作用时效，并在此基础上进一步探讨电针对模型大鼠海马BDNF mRNA表达的影响，旨在明确电针治疗抑郁症的部分机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SD健康雄性大鼠，清洁级，体质量173.97g±13.03g，购于北京维通利华实验动物技术有限责任公司(动物使用许可证号 SCKX(京)2004-0001)。除实验期间的特殊要求外，动物饲养于温度18℃ ～25℃、湿度552%的环境中，自然光照。

1.2 仪器及试剂

自制敞箱(80cm×80cm×40cm)，韩氏 LH 202型电针仪(北京华卫产业开发公司提供)，HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统(同济医科大学清平影像工程公司研制)，Olympus光学显微镜(日本)。BDNF检测探针提供者是北京奥科生物技术有限责任公司，BDNF原位杂交试剂盒由武汉博士德试剂公司提供。

1.3 动物分组

动物购回后适应性喂养1周，自由进食水。然后通过开野实验将水平运动次数加垂直运动次数不足30次或超过120次的大鼠剔除，再按体重随机分为正常组、模型组和电针组，每组10只，正常组每笼饲养5只，其余组单笼饲养。

1.4 造模方法

适应性喂养结束后，根据文献［1］方法改进，用慢性应激结合孤养的方式造模。给予模型组和电针组21d各种不同的刺激，包括冷水游泳(10℃，5min)、夹尾(3min)、禁水(24h)、禁食(24h)、电击足底(电压为30V，电击5s，间歇 5s，共进行 2min)、昼夜颠倒(24h)、温箱(40℃ 5min)，每天随机安排1种刺激方式，每种刺激在实验全程中使用3次。正常组大鼠不给予任何刺激。

1.5 电针方法

电针组于造模的第1天起，于每日上午应激刺激前1h进行电针。参照《实验针灸学》［2］取“百会”、“印堂”穴，用华佗牌30号13mm长的毫针进行针刺，均平刺0.5cm左右，针柄接韩氏电针治疗仪，频率2Hz，电流强度0.6mA左右，以大鼠头部微颤为宜。留针20min，每日1次，连续针刺21d。

1.6 行为学检测

于实验前 1d、实验第 7、14、21天测量大鼠体重，并进行开野实验及糖水消耗实验。

开野实验测定方法:本实验所用敞箱为立方体，周壁、底面为黑色，底面用白线划分为面积相等的25块。将大鼠置于敞箱底面的中心方格内，以动物穿越底面的格数(四爪均进入方格方可记数)为水平运动次数，以后肢直立次数(两前爪腾空或攀附箱壁)为垂直运动次数。每只动物测定1次水平运动次数及垂直运动次数，每次测定时间为3min，彻底清洁敞箱后再进行下1只大鼠的观察。

糖水消耗实验方法:于开野实验后将大鼠禁水24h，然后给予 1%(w/v)的蔗糖水溶液，加瓶重250g，同时禁食，24h后称量蔗糖水瓶的重量，计算大鼠在24h内蔗糖水消耗量。因不同体重的大鼠对蔗糖水的需求量各异，故统计时采用求实际糖水消耗与大鼠体重比值的方法(相对糖水消耗量)，以每千克动物体重消耗糖水重量(g/kg)计算。

1.7 原位杂交法检测海马BDNF mRNA表达

实验结束后的第1天每组随机抽取5只大鼠进行取材。用10%水合氯醛(0.5mL/100g)麻醉大鼠，开胸暴露心脏，经左心快速灌流生理盐水100mL左右，随即灌注含4%多聚甲醛、30%苦味酸和0.1mol/L的 PBS混合液150mL，持续30min。灌毕取全脑，浸入4%多聚甲醛内，4℃冰箱保存24h;取含海马脑段的组织，用0.1mol/L PBS浸洗后，脱水透明，石蜡包埋，切片机上做连续冠状切片(5μm)用于原位杂交检测。

(1)切片预处理:切片常规脱蜡至水;0.2mol/L HCl处理 20min，然后用 0.1%DEPC、0.01mol/L PBS、0.2%甘氨酸各洗 2次，每次 3min;蛋白酶 K 1μg/mL，37℃ 消化 15min ～20min，0.2% 甘氨酸、0.01mol/L PBS、0.1%DEPC各洗 2次，每次 3min;逐级乙醇脱水，每次5min;(2)预杂交:滴预杂交液20～30mL/片，42℃孵育 30min ～2h;(3)杂交:将探针DNA和杂交液混合后，煮沸变性10min，迅速置冰上冷却，然后每张切片滴加10μL～20μL变性杂交液，盖上清洁硅化盖玻片，用石蜡油将盖玻片四周封闭，将切片放入烤箱中加热85℃10min，迅速取出在冰上冷却3min，放入2×SSC湿盒内，42℃温箱孵育24h～36h，使其杂交;(4)洗涤:浸入无水乙醇2次，每次5min，清洗盖玻片;2×SSC，0.1%SDS振摇清洗2次，每次 3min;0.1×SSC，0.1%SDS振摇清洗2次，每次3min;(5)封闭:缓冲液Ⅰ洗3次，每次3min;缓冲液Ⅱ封闭 30min，37℃;(6)信号检测:地高辛-AP复合物 1∶5000，37℃ 1h;缓冲液Ⅰ清洗 3次，每次3min;缓冲液Ⅲ清洗3次，每次3min;显色过夜;TE缓冲液终止显色;脱水，甘油明胶封片。置光学显微镜下观察并照相。每只动物取相同部位的切片2张，选择海马CA3区为测定部位，光镜40×10倍条件下连续选取3个视野，用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统对其原位杂交阳性信号的表达面积及平均灰度进行测定。

1.8 统计方法

2 结果

2.1 电针对大鼠开野实验的影响

表1显示，应激前各组活动度水平相同(P＞0.05)。与本组实验前及正常组比较，应激刺激 7d后模型组水平运动及垂直运动均明显减少(P＜0.05或P＜0.01)。而电针组接受应激刺激7d以后的水平运动次数、垂直运动次数均高于模型组(P＜0.05～0.001)，说明慢性应激结合孤养可引发大鼠的抑郁症状，电针可以防治抑郁的发生。

表1 各组大鼠开野实验行为学比较(±s)

表1 各组大鼠开野实验行为学比较(±s)

项 目 组 别 鼠数 实验前 第7天 第14天 第21天水平运动 正常组 10 71.3±4.7 50.1±6.4* 50.2±8.5* 48.3±9.9＊＊模型组 10 66.8±4.6 29.2±6.3△ 24.7±7.0△ 15.2±3.3△电针组 10 72.2±7.2 55.3±6.5＊＊ 53.2±9.3* 56.1±8.0＊＊＊垂直运动 正常组 10 13.6±1.7 10.2±1.3* 8.7±1.3* 10.6±2.4*模型组 10 9.2±1.7 4.7±1.2△ 3.8±1.4△ 2.4±0.6△电针组 10 13.4±2.2 11.1±2.4* 8.2±1.8* 10.7±2.7*

注:与本组实验前比较:△P＜0.05;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

2.2 电针对糖水消耗实验的影响

表2显示，实验前各组大鼠的糖水消耗量相比差异无统计学意义(P＞0.05)。造模第21天时，模型组与正常组比较糖水相对消耗量显著降低(P＜0.05)，电针组与模型组比较糖水相对消耗量显著升高(P＜0.05)，模型组、电针组与本组实验前比较糖水相对消耗量均显著降低(P＜0.05)。

2.3 电针对海马区BDNF mRNA表达的影响

图1显示，正常组大鼠海马CA3区可见较多的BDNF mRNA杂交阳性信号，位于胞质中，呈紫蓝色;模型组大鼠海马CA3区的BDNF mRNA杂交阳性信号明显减少;电针组的BDNF mRNA杂交阳性信号介于两者之间。表3显示，阳性信号的细胞面积模型组显著低于正常组(P＜0.01)，电针组明显高于模型组(P＜0.05);平均灰度值模型组显著高于正常组(P＜0.01)，电针组明显低于模型组(P＜0.05)。灰度值的大小与阳性信号的多少成反比。因此统计结果表明，抑郁模型大鼠海马区 BDNF mRNA的表达明显减少，电针可促进海马区 BDNF mRNA的表达。

表2 各组大鼠糖水相对消耗量的比较(±s，g/kg)

表2 各组大鼠糖水相对消耗量的比较(±s，g/kg)

注:与本组实验前比较:△P＜0.05;与模型组比较:*P＜0.05

组 别 鼠数 实验前 第7天 第14天 第21天正常组 10 267.47±21.79 327.20±27.15 275.58±18.20 252.64± 9.93*模型组 10 308.32±11.98 280.80±14.18 274.90±14.20 203.09±14.54△电针组 10 316.68±19.44 281.10±15.77 267.40±13.50△ 262.88±23.70△＊

图1 各组大鼠海马CA3区BDNF mRNA表达光镜观察(原位杂交法×400，箭头所指为阳性细胞)

表3 各组大鼠海马CA3区BDNF mRNA表达变化的比较(±s)

表3 各组大鼠海马CA3区BDNF mRNA表达变化的比较(±s)

注:与模型组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组 别 鼠数 阳性细胞面积(μm2)阳性细胞灰度值正常组 5 444.60±32.76＊＊ 76.29± 8.78＊＊模型组 5 170.74±20.14 112.77±29.03电针组 5 268.76±33.58* 83.94±10.43*

3 讨论

BDNF对周围和中枢神经元均有广泛的作用［3］。很多研究资料表明，BDNF与中枢神经系统神经元的生存以及多巴胺能、胆碱酯能、5-羟色胺能神经元的可塑性密切相关;BDNF与酪氨酸激酶B结合后可启动细胞内信号传导途径，从而产生相应分子，对神经元起保护、促进再生作用;BDNF也可以经胞体顺行运输至轴突末端并释放，被次级神经元摄取和利用，参与突触可塑性。

最近的研究证实，神经营养因子与神经元的可塑性和存活有关，可能涉及抑郁症的发病和治疗机制。BDNF是5-羟色胺能神经元的生长因子，大鼠中脑慢性注射BDNF可增加5-羟色胺更新率和去甲肾上腺素水平;在成年大鼠大脑皮层注射BDNF甚至可以产生新的茂盛的 5-羟色胺神经末梢［4］。BDNF对5-羟色胺神经元生长和再生的作用提示了神经营养因子与抑郁症之间的关系。BDNF表达下调可能参与慢性应激抑郁症时海马结构和功能的改变。心理以及物理应激能下调海马BDNF mRNA表达，提示与应激相关的抑郁症与海马BDNF有密切联系［5］。临床资料显示，抑郁症患者血清 BDNF水平下降［6］;尸解研究发现，经抗抑郁药治疗的抑郁症患者，海马区 BDNF水平明显增加［7］。这些动物和临床实验的结果支持了BDNF在抑郁症病理机制中的作用，也说明脑内BDNF上调具有抗抑郁效应。

本课题组前期探讨了电针对慢性应激抑郁模型大鼠脑中BDNF相关转录因子表达的影响，本实验在前期工作基础上观察抑郁模型大鼠行为学的改变，同时应用原位杂交技术定量检测了电针对其海马BDNF mRNA表达的影响。根据吕梅等［8］对近10余年来针灸治疗抑郁症穴位使用频次情况的统计，本实验选用了其中效果最好、使用率最高的2个主穴，即百会和印堂。结果表明，电针“百会”、“印堂”可改善大鼠的抑郁症状，并可对抗应激引起的海马CA3区BDNF mRNA的减少，增加其表达量。说明电针对海马区BDNF mRNA的影响以及对海马神经元的保护作用是电针治疗抑郁症的机制之一，可能是电针刺激 BDNF mRNA的表达，延长海马CA3区神经元的轴突和增加神经元细胞树突分支的密度，起到了提高神经元重建的作用;神经元活性增强促进神经营养素的合成、释放和转移，BDNF的释放反过来又激活细胞内信号途径，增强突触效应的传递，从而能够提高动物情绪，改善抑郁的病理发展。

本文行为学观察所见模型大鼠糖水消耗量降低是由于造模应激刺激所致的抑郁症状引起还是造模导致的胃肠功能紊乱等因素的影响，有待在今后的研究中设立饮用纯水组进行比较，以便得出更加科学的结论。

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［5］Rasmusson AM，Shi L，Duman R.Downregulation of BDNF mRNA in the hippocampal dentate gyrus after re-exposure to cues previously associated with footshock［J］. Neurop-sychophar macology，2002，27(2):133-142.

［6］Monteleone P，Serritella C，Martiadis V，et al.Decreased levels of serum brain-derived neurotrophic factor in both depressed and euthymic patients with unipolar depression and in euthymic patients with bipolarⅠ and Ⅱ disorders［J］.Bipolar Disord，2008，10(1):95-100.

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［8］吕 梅，王玲玲.针刺治疗抑郁症选穴频次的分析［J］.针灸临床杂志，2003，19(8):15-16.