氟化镁涂层AZ31B镁合金体内成骨作用的研究

王宪涛，郭磊，柴宏伟，付玉平，管俊林

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001）

目前广泛应用的金属生物材料包括不锈钢、钛和基于钴铬的合金。这些金属生物材料在磨损过程中产生的有毒金属离子和/或者微粒导致的级联炎性反应降低了生物相容性。而且，这些金属生物材料的弹性模量和天然骨组织不相匹配，导致了应力遮挡效应，这个应力遮挡效应导致金属植入材料对新骨生长和重塑的刺激性减弱，降低了植入物的稳定性。在骨折完全愈合后需要二次手术将其取出，这增加了医疗费用的开支和患者的痛苦。大量实验研究证明，镁合金可作为一种可降解体内植入材料。Lambotte在1907年首次报道应用纯镁钢板和镀金的金属钉固定小腿下部的骨折。这个尝试由于纯镁在体内降解过快，术后8周分解，产生大量皮下气体而失败。Troitskii和Tsitrin在1944年报道了34例用镁加入少量镉制作而成的金属板和金属钉来固定各种各样的骨折；34例中9例失败，这些失败主要是由于感染；在所治疗的患者中，没有观察到血清镁的增高。大部分镁金属植入物的机械完整性能够维持6～8周，在10～12个月能够完全吸收。相反，一些植入物仅仅维持3～5周，这主要是由于骨折部位酸性增加所致。镁合金在体液环境中的腐蚀限制了其临床应用。许多实验研究显示，随着合金冶炼技术和材料表面改性技术的发展，镁合金的体内降解速率可以有效控制，而且表面处理可改善镁合金的表面生物活性。Makard研究发现镁合金在氢氟酸溶液中是相当稳定的，其原因是在氢氟酸溶液中镁合金材料表面可形成一层稳定的氟化镁（MgF2）［1］。MgF2常被应用于工艺方面以提高镁的耐蚀性［2，3］。但MgF2涂层镁合金的体内生物学行为及材料本身的降解鲜有报道。本研究制备MgF2/AZ31B材料并植入大鼠体内，评价其体内生物相容性及材料的降解特性，为镁合金在医用植入材料领域的应用奠定实验依据。

1 材料与方法

1.1 MgF2/AZ31B镁合金材料的制备

选用铸态AZ31B镁合金（成分：Al1.2%，Zn0.74%，Mn 0.35%，其余为Mg），将其加工成直径为2 mm，高度为5 mm的圆柱体，用乙醇和去离子水超声清洗，然后将其中的一半放入30%的氢氟酸溶液中，在30℃条件下浸泡72 h后将其取出，去离子水冲洗，真空干燥，环氧乙烷消毒备用。选用相同规格的钛合金（Ti-6Al-4V）材料做对照。

1.2 材料体内植入试验

取健康成年Wistar大鼠30只（由中国医科大学实验动物中心提供），体质量240～300 g。实验大鼠分组：Ti-6Al-4V对照组10只，AZ31B合金组10只，MgF2/AZ31B合金组10只。无菌条件下在距大鼠股骨髁关节面18～20 mm处用2 mm钻头作股横形打孔，将材料植入股骨干内。术后动物自由活动。于术后1至26周分别观察皮肤切口和植入材料周围组织炎性反应，取植入材料周围骨组织乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙后做苏木素-伊红（HE）染色，进行常规病理学观察。

1.3 合金的微观结构分析

将取出的金属材料浸入2%戊二醛内固定8 h后，75%乙醇脱水，真空干燥箱干燥，喷金，采用SSX-550型扫描电镜（SEM）观察体内植入镁合金的表面微观结构，并且进行材料表面的能谱分析。再将材料用多聚树脂包埋后，用2000碳化硅砂纸横向打磨，在SEM下观察材料横截面变化。用图形处理软件分析材料降解率（DR）：

2 结果

2.1 材料周围组织炎性反应评价

实验动物术后活动、进食正常，切口一期愈合、无感染，动物无死亡。术后1，4，12周，肉眼见各组大鼠材料周围可见到包裹膜，材料周围均无急性炎性反应，无脓肿形成，无组织坏死。材料周围骨组织HE染色发现，植入后1周，MgF2/AZ31B镁合金组材料周围未见明显炎性细胞浸润；AZ31B镁合金材料及Ti-6Al-4V材料周围则出现炎性细胞（图1）。植入后4周，MgF2/AZ31B镁合金组材料周围出现大量成骨细胞及新生骨组织；AZ31B镁合金材料及Ti-6Al-4V材料周围则出现大量分层排列有序的成纤维细胞，Ti-6Al-4V材料周围仍可见淋巴细胞浸润；植入后12周，MgF2/AZ31B镁合金组材料周围骨组织与8周时无明显差别。

2.2 材料微观结构分析

SEM观察发现，MgF2/AZ31B镁合金在植入第1周时表面有许多小孔（图2a），小孔的底部并未与基体AZ31相通；第4周时，MgF2/AZ31B镁合金材料表面出现大量细胞和有机蛋白（图2b）；第12周时，许多纤维化骨板出现在MgF2/AZ31B镁合金材料表面（图2c）；第12周时，这些骨板已发生骨化。而AZ31B镁合金在第1周时即可发现材料表面死亡细胞（图2d）；第4周时出现些许红细胞及蛋白；第12周时表面可见薄层蛋白（图2f）。

2.3 材料表面能谱分析

材料表面能谱发现（图3），MgF2/AZ31B镁合金材料和AZ31B镁合金材料表面出现钙与磷，且其含量在8周之内逐渐增高。但是，对比这2组我们可以发现，MgF2/AZ31B镁合金材料组钙与磷的含量增高更快。其中，第4周与第8周的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 材料降解分析

材料横断面电镜扫描观察显示，MgF2/AZ31B镁合金在动物体内降解更为均匀、缓慢，第26周时降解率约为20.68%，而AZ31B镁合金降解率约为33.7%。材料植入第26周时，Ti-6Al-4V没有降解（图4）。因此，MgF2能够延缓AZ31B镁合金在体内的降解。

3 讨论

氟对健康有积极作用。自然界中的植物普遍含有氟，正常成人体内含氟量约为2.6 g，占体内微量元素的第3位，主要分布于骨骼、指甲及头发中。WHO等世界性组织根据氟化物预防龋齿作用，将氟列为可能的必须微量元素，参与骨骼的代谢。流行病学观察指出，低氟区居民的骨密度降低及骨质疏松者明显地比高氟区多，临床应用氟化物治疗骨软化和骨质疏松有较好效果。

良好的生物相容性是材料植入体内的前提。而评价生物材料生物相容性较可靠的方法是动物体内植入试验。本实验采用AZ31B及目前广泛应用于临床的Ti-6Al-4V钛合金作对照材料。植入1周时MgF2/AZ31B镁合金材料周围未见明显炎性细胞浸润；植入4周时，MgF2/AZ31B镁合金材料周围无明显包膜形成。因此，MgF2/AZ31B镁合金材料生物相容性良好，适合进一步体内实验研究。

早期良好的成骨作用是骨组织内植材料的重要特性。骨髓基质细胞向成骨样细胞的募集是骨诱导的中心环节。本研究发现，术后第1周，我们发现大量骨髓基质细胞（图1）；在第4周，他们分化成为成骨细胞，此时还可发现新生骨组织。Cooper等［4］研究发现，经氟处理过的钛合金表面能够刺激间充质细胞和前成骨细胞增殖与分化，这可能与含氟复合物中释放的氟的作用有关［5］。Bellows等［6］证明氟能够引起成骨细胞的增殖、分化，并且伴有碱性磷酸酶和胶原的表达增加。体外研究发现，成骨细胞与氟处理过的材料联合培养，细胞增殖率更高［7］。经氟处理过的材料表面细胞增殖率更高，骨唾液酸糖蛋白和骨形态发生蛋白2的表达更高［8］。

骨组织的形成与植入材料表面形态密切相关。Davies等［9］认为植入材料表面形态对早期骨的形成、血块的形成及滞留有积极的作用。经过氟处理的TiO2，其植入体内后新生骨-材料接触面积较没有处理的TiO2明显增高［10］。在我们的研究中，MgF2涂层拥有粗糙的表面形态。在植入后第4周，MgF2/AZ31B材料表面就完全被大量细胞和有机蛋白覆盖。在术后第4周与第8周时，MgF2/AZ31B镁合金材料表面钙磷含量较AZ31B镁合金组显著增高。这说明AZ31B镁合金经过氢氟酸处理后，有利于材料周围骨生成。成骨细胞活动增加的可能机制包括氟对氟敏感碱性磷酸酶的诱导［11］，细胞内钙离子的释放［8］，生长因子信号途径中蛋白的相互作用。MgF2/AZ31B镁合金能够诱导早期骨生成增加的具体原因目尚不清楚。氟离子对成骨细胞的直接作用，氟离子对蛋白吸附和细胞吸附的间接作用，以及材料表面氟的间接作用均可能与钙磷的沉积有关［8］。

植入材料降解的可控性是可降解材料安全应用于临床的重要保证。在植入早期，MgF2涂层可有效的隔离基体AZ31B镁合金，使其与体液分开，免受腐蚀。体内实验发现，MgF2涂层能够早期降低镁合金LAE442的降解速率，在第12周时，无涂层LAE442降解率为10%，而氟化镁涂层LAE442降解率为4%［12］。本实验发现，MgF2涂层更有效地控制了AZ31B的降解；在植入后第26周，AZ31B的降解速率约为33.70%，而MgF2/AZ31B降解速率约为20.68%。我们认为，MgF2涂层控制AZ31B降解的可能与其良好的成骨作用有关：氟化镁陶瓷AZ31B镁合金材料周围骨组织形成较早，而骨组织的含水量较其他组织更低，进而延迟了AZ31B的降解。

MgF2/AZ31B镁合金植入动物体内早期未引起材料周围组织炎性反应，植入早期材料周围大量的成骨细胞黏附，材料表面钙磷含量明显增高，证实MgF2/AZ31B镁合金具有早期成骨作用。植入后第26周，MgF2/AZ31B镁合金降解率约为20.68%，较AZ31B镁合金组（33.70%）显著降低，MgF2可有效调控AZ31B镁合金基体在动物体内的降解速率。

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