PEG－6000胁迫下10个苜蓿品种幼苗期抗旱性比较

2011-08-20穆怀彬伏兵哲

草业科学 2011年10期

穆怀彬，伏兵哲，德英

（1．中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特010010；2．宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

苜蓿（Medicago sativa）富含蛋白质，有广泛的生态适应性和稳定的生产力，适口性好，是世界上栽培面积最广、最主要的优良豆科牧草之一，被人们誉为“牧草之王”。据文献资料［1］记载，苜蓿的起源中心是伊朗，之后逐渐传入其他国家，在中国已有2 000多年的栽培历史。目前，全世界种植苜蓿已达3 330万hm2。我国中西部和北方地区的中温带和半干旱区为苜蓿最佳生长区，苜蓿种植遍及我国北方14个省区，种植面积达280万hm2，对我国农牧业发展起到了重要作用［2］。同时，苜蓿具有抗干旱、耐盐碱、抗风沙、喜光照等特点，又是改良土壤、防止水土流失、保护生态环境的草种之一。

国内外已在苜蓿引种栽培、稳产高产、病虫害防治、遗传育种以及抗逆性等方面都做了不少的研究。其中，苜蓿的生态适应性研究一直是人们关注的焦点。目前，有关苜蓿生态适应性的研究和报道很多，研究领域逐渐从形态水平过渡到生理生化以及分子生物学水平［3－7］。

苜蓿生育期需水较多，通常比禾本科多2倍，每形成1g干物质需水700～800g，田间需水量达5 855m3／hm2［8］。而我国北方苜蓿主栽区干旱缺水，因此，苜蓿的抗旱性研究显得尤为重要。幼苗期是植物生长发育过程中的一个非常重要的时期，幼苗期抗旱性能的强弱直接影响到植物能否顺利完成整个生育期，故在实际生产中常说“保苗是关键”。本研究选择10个苜蓿品种，用PEG－6000溶液人工模拟干旱处理，在其幼苗期分析其叶片细胞膜透性，丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、类胡萝卜素（Car）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性研究其抗旱性，并探寻苜蓿幼苗期抗旱的生理生化规律，以期为苜蓿的选种栽培、优化育种等提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 试验材料供试苜蓿品种及其来源见表1。

1．2 试验设计在20℃室温下（经实测，试验期内水培室温度为17～24℃），采用Hoagland营养液配方水培10个品种苜蓿幼苗90～100株。水培装置包括：营养液盆、水培筐、沙网、碎石、细砂。播种前以上设备和材料均在90℃高温下灭菌5h，苜蓿种子经HgCl2消毒。当幼苗长至三到四叶期时进行干旱胁迫。试验设置5个水势：0（CK）、－0．3、－0．6、－0．9和－1．2MPa。处理后每2d进行称量补水以维持溶液浓度。处理后第7天取样，取样时间为08：00－10：00。除细胞膜透性即时测定外，其余样品均迅速冷冻在－20℃的低温冰箱中，以备测定其余指标。

表1 供试苜蓿品种及其来源

不同水势所需PEG－6000溶液的量计算公式［9］如下：

式中，ΨS为溶液的水势（MPa）；C 为PEG－6000溶液的浓度（g／kg）；T 为温度（℃）。

1．3 测定方法指标测定参照李合生［10］、张志良和翟伟箐［11］、高俊风［12］的方法。采用电导率仪法测定细胞膜透性；采用TBA－MDA显色法测定MDA含量；采用酸性茚三酮法测定Pro含量；采用95%乙醇提取法测定Car含量；采用氮蓝四唑光还原法测定SOD活性。

1．4 数据分析采用DPS v8．01和Excel 2003软件数据处理与分析。

目前，模糊数学中的隶属函数法被广泛应用在品种抗逆性评价。隶函数法避免了利用单一指标进行抗逆性评价所带来的片面性，它能综合所有指标，并在权重统一的情况下，对不同种或品种进行抗逆性排序，使评定结果更客观全面地接近实际情况。隶属函数的分析方法如下：

式中，Yij为i品种的j指标的隶属函数值；Xij为i品种的j指标的均值；Xj，max为各品种j指标均值的最大值；Xj，min为各品种j指标均值的最小值。若j指标与抗旱性呈正相关，则用公式（2）；若j指标与抗旱性呈负相关，则用公式（3）。

2 结果

2．1 干旱胁迫对苜蓿幼苗叶片细胞膜透性的影响随着干旱胁迫的加剧，苜蓿幼苗叶片的细胞膜透性总体呈上升趋势。水势从0到－1．2MPa，叶片细胞膜透性均值为 17．11%、18．50%、28．53%、42．75%和44．82%。随着水势的降低，细胞膜透性的变化呈现出明显的两个拐点，即－0．3和－0．9MPa水势。当水势高于－0．3MPa时，与对照相比细胞膜透性变化不大；当水势低于－0．3 MPa时，细胞膜透性开始大幅增加，表明苜蓿幼苗开始受到较为严重的干旱胁迫；当水势降到－0．9 MPa时，细胞膜透性较对照增加了149．85%；当水势低于－0．9MPa时，细胞膜透性的增幅开始下降，－1．2MPa水势的细胞膜透性只比－0．9MPa的增加了4．84%（图1）。结果表明，当水势在－0．9 MPa左右时，苜蓿幼苗叶片的细胞膜可能已被完全或接近完全破坏。苜蓿幼苗抗旱叶片细胞膜透性变化的临界值可能在－0．9MPa水势附近。

图1 干旱胁迫第7天时苜蓿幼苗叶片细胞膜透性的变化

2．2 干旱胁迫对苜蓿幼苗叶片中丙二醛含量的影响水势从0到－1．2MPa，叶片中MDA含量的均值分别为0．011 0、0．011 9、0．017 6、0．015 8和0．014 8μmol／g（表2）。总体看来，随着水势的降低，MDA含量呈上升趋势，且10个品种间MDA含量差异显著（P＜0．05）。当水势为－0．3MPa时，MDA含量与对照相比变化不大；当水势降到－0．6MPa时，MDA含量达到最大值；当水势低于－0．6MPa时，MDA含量不升反降但仍高于对照。结果表明，当水势达到－0．6MPa时，苜蓿幼苗叶片中的膜脂过氧化作用已接近峰值。苜蓿幼苗抗旱的临界水势可能介于－0．9～－0．6MPa。

2．3 干旱胁迫对苜蓿幼苗叶片中脯氨酸含量的影响随着水势的降低，苜蓿幼苗叶片中Pro含量总体呈先降后升的变化趋势，且10个品种间Pro含量差异显著（P＜0．05）。水势从0到－1．2 MPa，叶片中Pro含量的均值分别为104．17、75．28、184．89、289．54和248．23μg／g（图2）。当水势为－0．3MPa时，Pro含量较对照下降27．73%；当水势低于－0．3MPa时，Pro含量开始上升；当水势下降到－0．9MPa时，Pro含量较对照上升177．95%；当水势低于－0．9MPa时，Pro含量又略呈下降趋势。可能当水势达到－0．9MPa时，苜蓿幼苗叶片细胞中的Pro渗调机能已达极限。苜蓿幼苗抗旱的临界值可能在－0．9MPa水势左右。

表2 干旱胁迫第7天时苜蓿幼苗叶片中丙二醛含量的变化 μmol／g

图2 干旱胁迫第7天时苜蓿幼苗叶片中脯氨酸含量的变化

2．4 干旱胁迫对苜蓿幼苗叶片中类胡萝卜素含量的影响在干旱胁迫下，苜蓿幼苗叶片中Car含量呈上升趋势，且10个品种间Car含量差异显著（P＜0．05）。水势从0到－1．2MPa，叶片中Car含量的均值分别为0．071 0、0．103 5、0．111 0、0．138 0和0．119 6μmol／g（表3）。当水势下降到－0．9MPa时，Car含量达到最大值，较对照增加94．37%；当水势继续下降时，Car含量呈下降趋势。结果表明，当水势降到－0．9MPa时，苜蓿幼苗叶片细胞中的抗氧化物质的抵御能力可能已达极限。苜蓿幼苗抗旱的临界值可能在－0．9MPa水势左右。

表3 干旱胁迫第7天时苜蓿幼苗叶片类胡萝卜素含量的变化 μmol／g

2．5 干旱胁迫对苜蓿幼苗叶片中超氧化物歧化酶活性的影响随着干旱胁迫的加剧，苜蓿幼苗叶片中SOD活性总体呈先降后升再降的变化趋势。水势从0到－1．2MPa，叶片中SOD活性的均值分别为143．36、96．87、77．07、244．59和98．53 U／g（图3）。当水势为－0．3和－0．6MPa时，SOD活性均低于对照；当水势下降至－0．9MPa时，SOD活性大幅升高，较对照增加了70．61%；而当水势进一步下降，SOD活性又大幅下降，－1．2MPa水势时的SOD活性较对照下降了31．27%。可能当水势降至－0．9MPa时，苜蓿幼苗叶片细胞中SOD活性被完全激活；而当水势进一步降低，细胞可能已难以抵御干旱胁迫，导致SOD活性下降。苜蓿幼苗抗旱的临界值可能在－0．9MPa水势左右。

图3 干旱胁迫第7天时苜蓿幼苗叶片内超氧化物歧化酶活性的变化

2．6 苜蓿品种抗旱性综合评价

上述抗性指标的分析只能表明10个苜蓿品种在干旱胁迫下总的生理响应过程，而难以判断出具体品种的抗旱性强弱，这就需要借助数学方法来分析。根据隶属函数的分析方法，利用本试验所测的5个抗旱指标在不同水势下的均值，计算出10个苜蓿品种不同指标的隶属函数值，并再求其平均值，最后根据隶属函数的平均值进行排序，得出10个苜蓿品种的抗旱性强弱（表4）；依次为德国德贝＞大富豪＞阿尔冈金＞West blend＞FGZT 106＞苜蓿王1＃＞皇后2000＞爱菲尼特＞新疆大叶＞四季旺。

3 讨论

植物的抗旱机制涉及到一个复杂的体系，单一的指标很难说明某种植物（品种）的抗旱性的强弱，必须测定多种指标，并在此基础上作出综合评判。本研究所选的指标均是目前较常用且与抗旱性密切相关的生理生化指标，尽管随着研究进一步的深入，人们对于某些指标与抗旱性的关系产生了疑问。但可以肯定的是，这些指标与抗旱性是相关的，只是它们之间的关系可能并不是以前人们所认识的那样呈简单的线性关系。

表4 各抗旱指标的隶属函数值及10个苜蓿品种综合抗旱性排序

本研究表明，在－0．9MPa水势时，各测试指标的变化趋势均出现了明显的转折点，说明－0．9 MPa可能是苜蓿幼苗耐旱的关键水势点，同时苜蓿幼苗耐旱的极限可能是在一个范围内。根据本研究结果可以推断出苜蓿幼苗抗旱的临界值在－0．9 MPa水势左右。此外，值得注意的是，细胞膜透性及丙二醛含量在－0．3MPa水势时与对照相比变化不大，而脯氨酸含量与超氧化物歧化酶活性均在－0．3MPa水势时下降。这些变化表明苜蓿幼苗在－0．3MPa水势下几乎没有受到干旱胁迫的伤害。这可能是由于苜蓿本身具有较强的抗旱性，或者是由其他生理原因造成［13］。

目前对于游离脯氨酸是否适宜作为抗旱性指标的争议是最多的。最大的疑问在于，干旱胁迫下，游离脯氨酸的累积途径有很多，既可能有适应性的意义，又可能是细胞结构和功能受损伤的表现［14］。由此可见，脯氨酸的积累与植物的抗旱性之间可能并不是简单的正相关关系。但脯氨酸在干旱胁迫下大量积累，证明了其对干旱的敏感性，本研究也证实了这一点，因此还是可以把它作为评判品种抗旱性强弱的指标或者参数。但是，在本研究中也出现了随着胁迫的加剧，某些苜蓿品种的脯氨酸含量呈下降趋势的现象，这可能是苜蓿幼苗对于干旱胁迫的一种适应性反应，其叶片可能产生了暂时的生理休克［15］。

多项研究表明［16－18］，植物在遭受逆境胁迫时，其体内类胡萝卜素含量和超氧化物歧化酶活性均会上升，本研究也证实了这一点。一般认为，抗性较强的品种其叶片中类胡萝卜素的含量较高，并且具有较高的超氧化物歧化酶活性。但在本研究中，随着干旱胁迫的加剧，类胡萝卜素含量和超氧化物歧化酶活性出现下降，这可能是由于抗氧化保护系统的抵抗修复能力是有一定阈值的［19］，当胁迫超过一定程度后，抗氧化保护系统也将失去保护作用。此外，抗氧化系统保护能力的强弱并不在于单个物质的活性大小或含量多少上，关键在于它们之间的协同性是否好［20］，因为清除活性氧是分步骤的，抗氧化保护系统中的每种物质只在特定的步骤上起作用。

综上所述，随着干旱胁迫的加剧，苜蓿幼苗叶片中细胞膜透性、丙二醛含量和类胡萝卜素含量总体呈上升趋势；脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性总体呈先降后升的趋势；苜蓿幼苗期的耐旱极限范围可能在－0．9MPa水势附近；利用隶属函数分析得出10个苜蓿品种的抗旱性强弱为：德国德贝＞大富豪＞阿尔冈金＞West blend＞FGZT 106＞苜蓿王1＃＞皇后2000＞爱菲尼特＞新疆大叶＞四季旺。

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