CpG ODN联合凋亡肿瘤细胞相关抗原致敏树突状细胞杀伤SKOV3卵巢癌细胞的实验研究

叶明珠,李 娜,黄秀敏

(厦门大学附属中山医院妇产科,福建厦门 361004）

肿瘤免疫的最终目的即达到杀伤肿瘤细胞、阻止肿瘤的复发和转移。以往单纯利用凋亡肿瘤细胞作为肿瘤免疫的初始抗原,其因抗原性弱,难以达到理想的抗肿瘤免疫效果。近年来的动物实验研究表明,人工模拟细菌基因组DNA合成的含有至少一个未甲基化“CpG基序”的单链寡脱氧核苷酸是一类新型的免疫制剂,具有强效的免疫刺激功能。它能够以病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP）,促进多种免疫细胞的活化,进而诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫反应及持久的保护性免疫反应[1]。本研究采用人工合成的CpG ODN2006联合凋亡的SKOV3卵巢癌细胞相关抗原(tumor associated antigens,TAAs）体外冲击致敏DCs,探讨CpG ODN对DCs促分化成熟的作用;同时体外观察致敏DCs对细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs）杀伤SKOV3卵巢癌细胞活性的影响,以期为CpG ODN联合TAAs在抗卵巢癌免疫中的应用提供一些重要的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料人外周血每份20 ml,肝素抗凝;人卵巢癌细胞株SKOV3、人宫颈癌细胞株Hela、人肺癌细胞株Lewis由吉林大学病理教研室提供。

1.2 主要试剂CpG-ODN2006(5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'）,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,全硫代磷酸化修饰,PAGE纯化。MTT(华美生物工程公司）;丝裂霉素C(Sigma公司）;异硫氰酸荧光素(FITC）标记的CD1α、CD83、CD86和HLA-DR 单克隆抗体(BD Pharmingen公司）;GM-CSF/IL-4(Sigma Aderch公司）;IL-12 ELISA试剂盒(晶美生物工程有限公司）;RPMI1640培养基(Gibco公司）;淋巴细胞分离液(鼎国试剂公司）。

1.3 方法

1.3.1 人外周血单核细胞的分离和培养 取人外周血20 ml,肝素抗凝,用等体积Hanks液稀释后加入淋巴细胞分离液,1 500 r/min离心15 min,吸取界面细胞即获得外周血单核细胞,PBS洗涤2次。将获得的外周血单核细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基调细胞浓度为2.0×106/mL,置37℃,5%CO2孵箱培养2 h,洗去未贴壁细胞,获得贴壁的单核细胞,每孔加入含GM-CSF1000 KU/L、IL-41000 KU/L的完全培养基,隔天半量换液。第7天收集疏松粘附细胞,即为DC。倒置显微镜下观察DC的形态及生长情况。

1.3.2 TAAs的制备 将贴壁对数生长的SKOV3卵巢癌细胞经0.25%胰蛋白酶消化后,加入RPMI1640完全培养基,调细胞浓度为1.0×108/L,接种于96孔板,每孔100 μ L,置37℃,5%CO2孵箱培养。收集处于对数生长期的SKOV3细胞,调细胞浓度为1.0×1010/L,1 000 r/min离心5 min,沉淀用含10%胎牛血清的 RPMI1640悬浮,反复冻融(-80℃/37℃）3次,15 000 r/min离心30 min,收集上清液微孔滤膜过滤作为TAAs。

1.3.3 流式细胞仪检测CpG ODN致敏DCs表面分子的表达以完全培养基调DCs浓度至1×109/L,于24孔细胞培养板中每孔加入1 ml。分别加入10 mg/LCpG ODN 、10 mg/L TAA 、10 mg/LCpG ODN+10 mg/L TAA,设LPS阳性对照及阴性对照。培养72h后收集细胞,FACS检测细胞表面CD1α、CD83、CD86和HLA-DR表达水平,计算荧光染色阳性细胞的百分率。

1.3.4 ELISA法检测IL-12分泌水平 收集上述各组DCs的培养上清液,按ELISA试剂盒说明检测各组DC培养上清液中IL-12的分泌水平,酶标仪测定490nm波长下的吸光度值,计算IL-12的浓度。

1.3.5 T淋巴细胞的制备 将贴壁培养DCs后获得的非贴壁细胞经尼龙毛柱过滤后粘附去除B淋巴细胞,洗脱后所得细胞主要为T淋巴细胞。

1.3.6 测定致敏DCs对T淋巴细胞的增殖活性 将培养的各组DCs经丝裂霉素C处理30 min后,重悬于完全培养基中,分别以每孔2×105、1×105、5×104加入96孔板;另将获得的T淋巴细胞用完全培养基调细胞浓度 1×109/L,加入96孔板,每孔 100 μ l,总反应体积 200 μ l。置 37℃,5%CO2孵箱培养 5天。于培养结束前4 h以淋巴细胞加培养液作为对照组进行混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR）。加入 MTT(5 g/L）20 μ l,37℃,5%CO2继续孵育,4 h后弃去上清,加入DMSO 100 μ l,30 min后用酶标仪检测波长在570 nm处的吸光度(A值）,增值活性以刺激指数(stimulate index,SI）表示:SI=实验组A值/对照组A值。

1.3.7 致敏DCs诱导CTLs杀伤活性的检测 将获得的T淋巴细胞用完全培养基调细胞浓度为1×109/L,作为效应细胞。(1）CTLs杀伤活性的检测:在96孔板中分别加入T淋巴细胞100 μ l(每孔1×105）,按照不同效靶比(80∶1、40∶1、20∶1、10∶1）加入SKOV3细胞,总反应体积200 μ l。在反应体系中分别加入 unpulsed-DCs、CpG ODN-pulsed-DCs、CpG ODN+TAA-pulsed-DCs、TAA-pulsed-DCs,每孔 1×104。每组设4个复孔,培养48 h,MTT比色试验法测定各孔A值,单纯效靶细胞共育作为对照。(2）CTLs特异性杀伤活性的检测:在96孔板中分别加入T淋巴细胞100 μ l(每孔 2×105）,按照不同效靶比(80∶1、40∶1、20∶1、10∶1）分别加入 SKOV3 细胞 、Hela细胞和Lewis细胞,总反应体积200 μ l。在反应体系中加入CpG ODN+TAA-pulsed-DCs,每孔1×104,每组设 4个复孔,培养48 h,杀伤率按下列公式计算:杀伤率=100%×[1-(实验组A值-效应细胞组A值）/靶细胞A值]。

1.4 统计学处理应用SPSS11.0软件进行统计学分析,结果以(¯x±s）表示,采用方差分析、LSD 检验等方法。

2 结果

2.1 ODN2006致敏DCs表型功能分析FACS测定结果显示,培养72 h后CpG ODN-pulsed-DCs和CpG ODN+TAA-pulsed-DCs的表型发生明显变化,其表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达明显上调,三者阳性细胞百分率均显著高于unpulsed-DC组,而CD1α在各组间表达水平无明显差别。致敏DCs培养上清中IL-12分泌水平测定结果显示:unpulsed-DC组、TAA-pulsed-DC组培养上清液中IL-12的分泌水平为(60±9）ng/L和(86±13）ng/L,而在CpG ODN-pulsed-DC组和CpG ODN+TAA-pulsed-DC组培养上清液中IL-12水平显著增加,分别为(375±32）ng/L和(437±65）ng/L,二者与 unpulsed-DC组和TAA-pulsed-DC组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01）。

2.3 ODN2006对DCs刺激T淋巴细胞增殖的影响各种致敏因素诱导的DCs均可不同程度地刺激T淋巴细胞的增殖,且随着致敏DCs密度的增加,其T细胞的增殖活性逐渐增强。CpG ODN-pulsed-DC组和CpG ODN+TAA-pulsed-DC组在相同效靶比下对T淋巴细胞的刺激指数均无显著性差异(P＞0.05）,但与unpulsed-DC组和TAA-pulsed-DC组相比,当T∶DC比值接近10∶1时,差异即有统计学意义(P＜0.01）,如表1所示。

表1 ODN2006致敏DCs对 T淋巴细胞增殖活性的影响(SI,±s）

表1 ODN2006致敏DCs对 T淋巴细胞增殖活性的影响(SI,±s）

注:相同T∶DC比值下,CpG ODN-pulsed-DC组与CpGODN+TAA-pulsed-DC组组间差异无统计学意义(P＞0.05）,*与unpulsed-DC组比较,P＜0.05,△与unpulsed-DC组比较,P＜0.01,#与TAA-pulsed-DC组比较,P＜0.01

组 别 孔数T∶DC 20∶1 10∶1 1∶1 unpulsed-DC 6 1.07±0.41 1.14±0.50 1.10±0.26 CpG ODN-pulsed-DC 6 1.60±0.28△ 3.12±0.57△# 3.87±0.91△#CpGODN+TAA-pulsed-DC 6 1.81±0.54△# 3.56±0.79△# 4.50.±0.65△#TAA-pulsed-DC 6 1.26±0.37 1.52±0.29* 1.51±0.43*F值 9.402 13.196 24.732 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.4 CTLs对SKOV3卵巢癌细胞的杀伤活性通过测定各组致敏DCs诱导的CTLs对SKOV3卵巢癌细胞的杀伤活性,结果显示:CpG ODN+TAA-pulsed-DC组可增强CTLs对SKOV3细胞的杀伤能力,相同效靶比下与 unpulsed-DC组、CpG ODN-pulsed-DC组和CA125-pulsed-DC组相比差异均具有统计学意义(P＜0.01）。当效靶比低至20∶1时即呈现对肿瘤细胞的杀伤活性,且随效靶比的升高,杀伤活性逐渐增强,杀伤率最高达56.1%,如表2所示。为进一步证实ODN2006联合TAA致敏DCs所诱导的CTLs对SKOV3细胞具有特异性杀伤活性,我们测定了不同效靶比下CpG ODN+TAA-pulsed-DC所诱导的CTLs对不同肿瘤细胞的杀伤率。结果显示,该种致敏方式能诱导T淋巴细胞产生对SKOV3细胞的特异性杀伤,而对Hela细胞和Lewis细胞无明显杀伤活性。

表2 CTLs杀伤SKOV3卵巢癌细胞的活性比较(%,±s）

表2 CTLs杀伤SKOV3卵巢癌细胞的活性比较(%,±s）

注:相同效靶比下比较,*与unpulsed-DC组比较,P＜0.01,△与TAA-pulsed-DC组比较,P＜0.01,#与CpG ODN-pulsed-DC组比较,P＜0.01

组别 孔数效靶比10∶1 20∶1 40∶1 80∶1 unpulsed-DC 5 8.6±1.9 11.7±5.8 11.0±7.2 13.1±8.6 CpG ODN-pulsed-DC 5 10.3±3.7 15.0±3.9 23.9.±8.5*△ 29.7±14.3*△CpGODN+T AA-pulsed-DC 5 13.2±6.4* 24.7±9.0*△# 40.5±11.6*△# 43.9±10.8*△#TAA-pulsed-DC 5 10.8±5.2 13.2±7.1 14.5±9.7 16.2±6.3*F值 18.930 39.161 31.852 34.892 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

3.1 树突状细胞作为机体内最主要的专职抗原呈递细胞(APC）在细胞免疫应答中起着不可替代的作用,其分化成熟与否直接关系到能否产生有效的抗肿瘤免疫效应。然而,经研究发现正常情况下体内大多数DCs都处于非成熟状态,表达低水平共刺激分子和粘附分子,体外激发MLR能力较弱。因而在试图应用DCs进行肿瘤免疫靶向治疗的研究中急需一种可有效激活DCs、促使DCs由非成熟状态转变为成熟状态的免疫佐剂。近年来研究显示,人工模拟细菌基因组DNA合成的CpG ODN,因其含有非甲基化的CpG基序,可以通过与细胞内内质网膜上的Toll样受体-9(Toll-like receptors,TLR-9）结合,诱导多种免疫细胞特别是B细胞、pre-DC2的活化、增殖和分化,诱导多种细胞因子的产生[2]。本研究直接向外周血来源的DCs培养环境中加入了ODN2006,分析比较其对DCs表面共刺激分子及培养上清液中IL-12分泌水平的影响,发现添加ODN2006后,表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达均显著增高,培养上清液中的IL-12分泌水平也较未刺激组有大幅度的升高,联合加入TAA后这种刺激作用进一步增强,说明ODN2006可有效诱导DCs的成熟,促进DCs表达协同共刺激分子,其与TAA联合应用能够产生协同作用。

3.2 以往的实验研究发现,许多合成的多肽疫苗可以引起较强的T淋巴细胞反应,但是对于已经存在的肿瘤没有明显的杀伤活性,这主要是因为免疫系统很难将这些可溶性蛋白抗原交叉递呈给细胞免疫系统。因此,选择能够增强交叉递呈作用的免疫佐剂将无疑是抗肿瘤免疫的先决条件。本研究发现经ODN2006+TAA致敏后的DCs在同种MLR中均可刺激T淋巴细胞的大量增殖,与未致敏组和单纯TAA致敏组相比有显著性差异。有研究显示,CpG ODN对纯化的T细胞没有刺激增殖能力,而体内应用CpG ODN除了能够显著活化CD8+记忆性T细胞外,对所有T细胞均有一定程度的活化,故推测这种刺激活性可能主要依赖于APC分泌的I型干扰素及IL-12。此外,有学者发现CpG ODN可通过非IFN-R途径介导DCs分泌大量的I型干扰素。因此,结合本实验的研究结果,我们推测CpG ODN可能通过促进DCs分泌I型干扰素和IL-12,进而增强DCs的抗原递呈能力,诱导T淋巴细胞的活化与增殖。

3.3 研究表明,肿瘤细胞逃逸宿主免疫应答的主要原因在于肿瘤细胞自身具有的免疫原性较弱,不能激发机体有效的免疫反应,因而增加肿瘤疫苗免疫原性的净效应就是要刺激宿主的免疫系统对肿瘤抗原产生有效的捕获、加工和递呈。本研究从凋亡的SKOV3卵巢癌细胞中提取肿瘤相关抗原,试图通过此种联合致敏方式获得特异性的抗肿瘤免疫反应。经研究证实,我们选用的ODN2006与TAA联合致敏DCs后可显著增强CTLs对SKOV3细胞的免疫杀伤活性,杀伤率最高达 56.1%,同时对Hela细胞和Lewis细胞却无明显的杀伤活性,从而进一步说明这种联合致敏方式所诱导的CTLs对靶细胞的杀伤具有抗原特异性。动物在体实验显示,经CpG ODN免疫后的小鼠能够诱导产生Th1型免疫反应,并通过释放细胞因子等激活抗原特异性CD8+T细胞,进而引起CD8+T细胞依赖性的细胞毒性反应[3-4]。国外有学者通过研究小鼠B16F1黑色素瘤模型发现,将CpG ODN与B16F1肿瘤细胞联合免疫荷瘤小鼠,可诱导产生长期持续的CTLs反应,促使肿瘤消退,延长荷瘤小鼠的生存期[5]。综上所述,我们推测CpG ODN可能通过增强DCs对肿瘤相关抗原的加工递呈功能,通过致敏DCs分泌相关细胞因子等促进CTLs活化与增殖,进而诱导其产生对SKOV3卵巢癌细胞的特异性杀伤活性,这为体内应用CpG ODN和TAA进行抗卵巢癌免疫奠定了实验基础。

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