ABO血型测序法对B(A）血型等位基因的检测分析

张心怡,田晓丰,刘铁梅

(1.长春市中心医院输血科,吉林长春 130051;2.吉林大学第二临床学院;3.吉林大学中日联谊医院）

1 材料与方法

1.1 样本来源收集2010年在吉林大学中日联谊医院输血科30例健康献血者EDTA抗凝全血(建立ABO基因测序法的可靠性）。2例健康体检正反定型不符标本(长春市中心血站提供）,系母子关系。

1.2 血型血清学检测正定型试验采用长春博德生物技术有限责任公司生产抗A、抗B血型定型试剂(单克隆抗体）;反定型试验用上海血液生物医药有限责任公司生产A、B、O红细胞,生理盐水及37℃水浴箱。应用吸收放散技术证实弱的A或B抗原[3]。单克隆抗-H试剂检测红细胞上H抗原含量。

1.3 所有标本用血清学方法检测ABO血型后,采用盐析法提取DNA。

1.4 ABO血型基因测序方法的建立每份标本分别扩增ABO血型基因第6和第7外显子片段。引物序列如下:5'-CGGAATTCACTCGCCACTGCCTGGGTCTC-3',5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCC-3'用于扩增ABO血型基因的第6外显子,扩增产物为278 bp。引物 5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3',5'-CGGGATCCCCGTCCGCCTTGCAG-3',用于扩增ABO血型基因的第7外显子,扩增产物为310 bp。内对照为人类生长激素(HGH）基因特异性引物,HGH-A 链引物序列为:5'-TGCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3',HGH-B链引物序列为:5'-CCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTG-3',扩增产物为434 bp。

1.5 PCR扩增体系为50 μ l DNA Taq酶 0.5 u,10×PCR buffer:5 μ l,dNTP:1 mM,每条引物终浓度 1 μ M 和 DNA 2 μ g;循环参数为 94℃,5 min;94℃,30 s;60℃,30 s;72℃,50 s;30个循环后72℃,5 min结束扩增。将扩增产物送至上海生工直接双向通测。

2 结果

2.1 血清学检测结果30例健康献血者ABO血型正反检测结果均一致,此结果用于建立ABO基因测序的基础。2例母子关系标本的红细胞与抗-B发生较强凝集(4+）;与抗-A发生弱凝集(1+）反定型血清中含有抗-A。红细胞上H抗原含量接近O型细胞,明显超过正常B型细胞上H抗原的含量;吸收放散试验可检出红细胞上的A抗原,结果见表1。

表1 血清学检测结果

2.2 ABO血型基因测序结果 30例正反定型结果一致的标本测序结果也同血清学检测结果,说明测序方法确立。2例母子关系标本的测序结果均含有正常的O1等位基因,而他们的B等位基因均在正常B*101基因序列的基础上存在单碱基突变803C→G,如测序图1所示。

图1 B血型基因测序结果图

3 讨论

B(A）型是罕见的ABO亚型,1985年发现其表型[4],红细胞遗传学上认为是B型,红细胞上有正常含量的B抗原和少量的A抗原,其血清中含有抗A。A型和B型血的cDNA有7处核苷酸不同。迄今发现的A基因796位为C,803位为G;B基因796位为A,803位为C[5]。2例母子血型基因测序结果796位为A,803位为G,很好得解释了标本与抗-A也有弱凝集,是因为这样的人群在表达B糖基转移酶时少量得合成了A血型物质[5]。血清学检测方法容易在特殊血型的诊断中出现误判或结果不明确[6],或表现为ABO亚型[7]。我们利用分子生物学的方法直接对标本测序就可以揭示其基因背景,也有可能发现新的基因多态性。对B(A）这样血型的准确、及时定型非常重要,只有准确诊断才能为临床安全输血提供保证,避免发生医疗纠纷等。另外对血型中亚型的资料积累,能够更好地解析血型遗传规律,为人类学研究做出更多贡献。

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