糖尿病对骨髓干细胞血管新生潜能的影响

刘泽林，陈 燕

（1.南昌大学第四附属医院内分泌科，南昌330003；2.武警江西总队医院内科，南昌330001）

近年的研究发现骨髓干细胞具有诱发血管新生的潜能，并且能用于改善缺血性脏器的血流和功能［1］。基于这一特性，国内外已广泛开展了利用病人自体的骨髓干细胞来治疗冠心病及其他缺血性心血管疾病的临床试验［2］。尽管很多临床试验报告了这一新治疗技术是安全的，但有些患者的治疗效果并不理想［3］。其原因可能与患者自体的骨髓干细胞的质量及缺血性脏器的局部状况有关。有研究资料显示，糖尿病等可能导致骨髓干细胞受损，并影响其诱发血管新生的潜能［4－5］。本研究的目的旨在调查糖尿病对骨髓干细胞产生血管生长因子（VEGF）的能力以及骨髓干细胞向内皮细胞分化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1）实验动物：雌性18周龄的糖尿病肥胖大鼠（实验组）和非糖尿病健康大鼠（对照组）大鼠各20只（均由日本山口大学医学部试验动物中心提供）。

2）主要试剂：VEGF测定试剂、RPMI1640培养基等试剂均由日本山口大学医学部试验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 骨髓干细胞的采集及培养

取出大腿骨并把骨髓细胞单离浮游于PBS溶液中。应用比重离心法从骨髓细胞中分离纯化骨髓单核细胞。把新鲜分离采集的骨髓单核细胞浮游于RPMI 1640培养基（3×106cells·mL－1）中，并添加15%胎儿牛血清（Gibco）、100U·mL－1青霉素和100μg·mL－1链霉素。细胞培养于37℃含5%CO2湿化培养箱内。

1.2.2 细胞生存的测定

在细胞培养第3、7天后取出培养细胞并用0.4% 台盼蓝溶液染色后测出生存的细胞数。按培养前的细胞总数计算出细胞的生存率。

1.2.3 VEGF浓度的测定

在培养第3、7天后，取出培养基上清液冷冻保存。应用酶联免疫标记（ELISA）法分别测定培养基上清液中VEGF的浓度。

1.2.4 骨髓干细胞的内皮细胞分化检测

细胞培养于4井室培养玻片（铺有0.2mg·mL－1纤维连接蛋白）上，并添加50ng·mL－1VEGF、5ng·mL－1碱性成纤维细胞生长因子和5ng·mL－1胰岛素样生长因子－1于培养基中。培养第7天后，用1%福尔马林固定细胞并用FITC荧光标示的抗VE－cadherin抗体进行免疫染色来检测内皮细胞分化潜能。

1.2.5 统计学方法

2 结果

2.1 细胞生存率

细胞培养第3天细胞生存率：实验组与对照组分别为（30.1±2.4）%、（31.9±3.8）%，2组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；细胞培养第7天细胞生存率：实验组与对照组分别为（18.5±3.1）%、（20.4±1.9）%，2组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 VEGF浓度

培养第3、7天后培养基上清液中VEGF的浓度：实 验 组 分 别 为 （134.8±27.5）、（282.7±25.2）ng·mL－1，对照组分别为 （189.1±25.6）、（370.2±40.1）ng·mL－1，2组相比，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 骨髓干细胞的内皮细胞分化

实验组培养第7天后骨髓干细胞的内皮细胞分化率为（14.7±4.5）%，显著低于对照组的（32.8±5.6）%（P＜0.01）。

3 讨论

本研究显示糖尿病大鼠的骨髓细胞产生血管新生子VEGF的量要比非糖尿病健康大鼠明显减少。在相同培养条件下，糖尿病大鼠的骨髓细胞定向分化成内皮细胞的比率也比非糖尿病健康大鼠明显降低，这些结果证明了糖尿病可以导致骨髓细胞的功能低下。其原因和分子机制还不明白，这有可能是由于糖尿病状态下很多炎症性因子升高而且氧化应急增强，抗氧化功能减退［6］，从而影响到骨髓干细胞的细胞周期调节因子和干细胞维持所需因子的改变，最终导致骨髓干细胞的凋亡，分化成熟，以及功能低下。

以前的研究发现，糖尿病病人血液中的内皮前驱细胞数量减少［7］。由于血液中的内皮前驱细胞来源于骨髓干细胞，这可能是由于糖尿病引起骨髓干细胞的功能损害，从而导致骨髓中放出到血液中的内皮前驱细胞数量减少。由于内皮前驱细胞具有修复血管内皮的作用，血液中的内皮前驱细胞数量减少将会引起受到损害血管内皮细胞得不到及时修复，因而产生血栓形成和血管闭塞，也可以说明为何在临床上糖尿病病人并发缺血性疾病的比率要比健康人高。

尽管本文没有使用缺血性动物模型对糖尿病和健康鼠的骨髓细胞诱发血管新生作用进行比较，但从本文的结果可以推测出糖尿病患者的自身骨髓细胞诱发血管新生作用可能降低，因而限制了使用糖尿病病人的自身骨髓干细胞来治疗他们的缺血性疾病或其他疾病。由于目前还不明白糖尿病是如何影响骨髓细胞功能的分子机制，因此，下一步的工作应该是去揭开糖尿病导致骨髓细胞功能损害的分子机制之谜，然后找到使其功能得到恢复的方法。这将会大大改善糖尿病病人的自身骨髓干细胞用于诱发血管新生等治疗的效果。同时，糖尿病病人的骨髓细胞功能的恢复也有可能使血液中的内皮前驱细胞数量升高［8］，从而将降低缺血性疾病的并发率。

综上所述，糖尿病不仅可以导致骨髓细胞产生血管新生因子的能力降低而且会导致骨髓干细胞定向分化成内皮细胞的功能低下，这将需要医学工作者对糖尿病病人在利用自身骨髓干细胞治疗缺血性疾病之前，找到一种有效的方法使其骨髓干细胞的机能得到恢复和改善。

［1］ Kawamoto A，Asahara T，Losordo D W.Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization［J］.Cardivasc Radiat Med，2002，3：221－225.

［2］ Eriko T Y，Hiroaki M，Toyoaki M，et al.Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischemia by autologous transplantation of bone－marrow cells：apilot study and randomized controlled trial［J］.Lancet，2002，360：427－435.

［3］ Jude E B，Oyibo S O，Chalmer N，et al.Peripheral arterial disease in diabetic and nondiabetic patients：a comparison of severity outcome［J］.Diabetes Care，2001，24：1433－1437.

［4］ Hamano K，Nishida M，Hirata K，et al.Local implantation of autologous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease：clinical trial and preliminary results［J］.Jpn Circ J，2001，65：845－847

［5］ Hirata K，Li T S，Nishida M，et al.Autologous bone marrow cells implantation as therapeutic angiogenesis for ischemic hindlimb in diabetic rat model［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284：H66－H70.

［6］ Sorrentino S A，Bahlmann F H，Besler C，et al.Oxidant stress impairs in vivo reendothelialization capacity of endothelial progenitor cells from patients with type 2diabetes mellitus：restoration by the peroxisome proliferator－activated receptor－gamma agonist rosiglitazone［J］.Circulation，2007，116（2）：163－173.

［7］ Fadini G P，Sartore S，Albiero M，et al.Number and function of endothelial progenitor cells as a marker of severity for diabetic vasculopathy［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26（9）：2140－2146.

［8］ Ii M，Takenaka H，Asai J，et al.Endothelial progenitor thrombospondinK－1mediates diabetes－induced delay in reendothelialization following arterial injury［J］.Circ Res，2006，98（5）：697－704.