Akirin1基因在肌肉发生中的作用

汪海鹏,原雪莹,倪 华

(东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

脊椎动物的肌纤维在胚胎期已经形成, 出生后数目不再改变。肌肉生长主要依赖肌卫星细胞的增殖分化而导致现有肌纤维长度和周径的增加,而不再依赖肌细胞数目的增多即细胞的增生。研究肌肉分化的机制对于了解胚胎发育、细胞增殖与分化具有重要意义。已经公认，脊椎动物生肌过程主要由生肌决定因子家族(MRFs)、心肌细胞增强子2家族(MEF2s)以及肌肉生成抑制素myostat in(MSTN)等调控。其中MRFs与MEF2s二者相互促进并维持其表达，在不同的发育阶段促进肌肉分化。MRFs除了调控肌肉生成，还能够诱导成纤维细胞、脂肪细胞等多种不同来源的细胞向肌肉方向分化。MSTN则作为肌肉生长的抑制子负调节肌肉发生。Aki r in1基因是近年来新发现的受MSTN特异性下调的靶基因。现就国内外对Aki r in1基因的定位与结构、表达与调节、生物学功能等方面的研究进展综述。

1 Akirin1基因结构及定位

Marshal l等通过比较MSTN敲除的小鼠和野生型小鼠肌肉中mRNA的基因表达差异鉴定出MSTN下游的一个新基因mighty[1]。Goto等研究了果蝇和小鼠的Aki r ins，后统一将mighty命名为Akirin1[2]。Akirin1属于Akir ins家族，该家族还含有Aki r in2。有研究表明，Aki r in2单核苷酸多态性影响牛肉大理石花纹的含量[3]。小鼠的Aki rin1定位于4D2.D，编码2271 bp的mRNA，含有576 bp的ORF。牛的Aki rin1位于3号染色体，DNA长12 212 bp，mRNA长3 760 bp，含有578 bp的CDS，编码193个AA。Akirin1在各个物种间相对保守，但并不与目前已知的任何蛋白具有较高的同源性[4,5]。Akirins含有一个保守的功能性结构域即N末端的核定位信号NLS。Aki rin1蛋白在核中聚集成斑，核周围和内质网也有分布。Akir in1与核纤层蛋白有着相同的定位，二者一起结合定位在DNA调节区域的基质附着区(MARs)，这种结合可能是Aki rin1调节下游靶基因表达的基础。Beut ler等证明，Akirin1能与DNA结合蛋白，或者染色质重塑蛋白如HAT(组蛋白乙酰转移酶)相互作用从而启动下游基因表达[6]。

2 Akirin1的表达模式

张志强等发现，Aki r in1在仔猪的18种组织中均有分布，且大部分表达水平较高，提示Aki r in1参与猪早期发育[7]。Marshal l等发现Akir in1在小鼠的多种组织中表达，肌肉中的表达相对低于其他组织，如脑、睾丸、肺、肾、肠和肝，表明Aki r in1在体内有着广泛的作用[1]。成体后的肌肉组织在受到损伤后能够自我修复并重生，肌卫星细胞(SC)的激活是肌肉重生的关键步骤。激活的SC进入细胞周期，然后自我更新或者分化形成肌管。qRT-PCR和Western blot显示，激活的SC中Aki rin1表达水平比静止的要高，这表明Aki r in1可能激活SC进而促进肌肉分化。在心脏毒素notexin注射模型和肌肉切割损伤模型的肌肉修复和重生过程中，Aki r in1的表达水平随重生进程逐渐升高。这些表明，Akir in1的表达上调促进肌肉重生。Akirin1除了在肌肉组织中，还在炎症细胞如巨噬细胞中表达。Salerno等在小鼠的腹膜和骨髓起源的巨噬细胞中都检测到Akirin1的表达，表明Akirin1可能参与炎症反应[8]。

3 Akirin1基因的功能

3.1 Akirin1的过表达能够促进肌肉分化与再生

Aki r in1在C2C12细胞中的过表达能够导致细胞周期的提前退出，肌肉分化标志性分子如p21，MyoD，MyoG和MyHC的表达增强，融合指数(肌管中细胞核占总细胞核的比例)较对照组显著上升，最终形成肥大的肌管。在mdx小鼠(一种肌营养不良的小鼠模型)中过表达Akirin1可以增加肌纤维横截面积，并形成短粗而肥厚的肌管。HE染色发现相对于野生型mdx小鼠，过表达Akirin1组的胫骨前肌的重量比对照组要重，并且有着更多的肥大的肌纤维，肌纤维形态更健康，也更容易鉴定[1]。另外，通过Van Geisen染色发现，与对照组相比，Akirin1的过表达还降低了肌肉组织的纤维化，肌肉的退行得到了改善。这些结果提示，外源表达Akirin1能够促进成肌细胞分化。

哺乳动物成体骨骼肌是一个动态的组织，循环发生着损伤和修复。肌肉损伤伴随一系列的事件发生，如炎症反应、肌纤维重生、纤维化等。多种生长因子，如IGFs、FGFs、HGFs等参与该过程。肌肉重生时的表达分析表明，Akir in1早在肌肉重生的第2天就开始表达，并且随着新生肌管的形成表达逐渐升高。这些提示，Aki rin1的表达与肌肉再生过程密切相关。

3.2 参与炎症反应并增强细胞的趋化迁移能力

肌肉重生包括两个重要步骤：炎症应答后的细胞迁移、肌肉重生。在肌肉再生早期，损伤的肌肉能释放炎症因子向周围的炎症细胞，如中性白细胞、巨噬细胞等提供趋化信息，以浓度梯度诱导炎症细胞向肌肉损伤处迁移。巨噬细胞主要分泌蛋白水解酶吞噬降解细胞碎片，并分泌炎症因子以吸引成肌前体细胞迁移至受损位置。另外，还可以通过释放肌肉再生因子调节肌肉再生。Sun等认为，Akirin1可能与染色质结合来参与NF-κB调控的免疫反应，Akirin1对果蝇S2细胞抵抗革兰氏阴性菌侵染时产生抗菌肽是必须的[9]。Salerno等发现巨噬细胞也表达Akirin1，过表达Akirin1导致了巨噬细胞的迁移性增加，促使损伤部位的炎症细胞发挥相应功能。

哺乳动物胚胎期肌肉生成时成肌细胞也一直在迁移。成肌细胞不仅从体节迁移到肢端产生肌肉系统，在肌肉内部也能够迁移，彼此融合或者和现存的肌管融合[10]。C2C12以及过表达Akirin1的细胞在2%HS+5%CEE(最适化学引诱剂培养基)存在时有着相同的迁移能力。但CEE撤去时，对照组C2C12迁移数显著减少，而Akirin1过表达细胞系则和CEE存在时迁移效果一样，表明Akirin1的过表达增强了成肌细胞的趋化运动能力。成肌细胞迁移需要肌动蛋白actin的聚合，actin聚合形成板状伪足和丝状伪足以提供趋化运动的动力。Marshal l等认为，在成肌细胞中，Aki r in1通过重塑肌动蛋白细胞骨架，以PI3K依赖的方式形成更有效的板状伪足，增强巨噬细胞与成肌细胞的趋化作用[1]。

4 Akirin1基因的调节网络

4.1 Akirin1在转录水平受到MSTN的负调节

Marshal l等发现，Aki r in1在小鼠肌肉中的表达相对低于其他组织，如脑、肠和肝等，但肌肉组织中的mRNA水平在MSTN敲除显著上调，而其他组织中敲除前后未见明显变化。对Akir in1基因启动子活性研究发现，MSTN能以剂量依赖的方式抑制Akir in1启动子的活性。而先经MSTN处理，再向培养体系中添加MSTN的拮抗剂MSTN-ant1后，Akirin1启动子活性逐渐恢复。这些结果表明，MSTN在转录水平上调节Aki r in1基因的表达。MSTN的功能主要通过I型受体ALK5，II型受体ActRIIB和smad2/3这些受体实现。将Akirin1启动子分别和dnActRIIB、dnALK5受体或者dnSmad2/3这些显性负突变载体共转染C2C12细胞，发现外源MSTN并不影响Aki rin1启动子的活性。Akirin1依然能够表达，证明MSTN对Akirin1的启动子活性的调节通过这些下游受体实现[1]。Aki r in1在野生型和MSTN-nul l的小鼠肌肉损伤后的第5天开始上调，此时成肌细胞彼此融合形成新的肌管，或者和现有的肌管融合。随后Akir in1在终末分化时一直下调，最终肌肉分化完成，SC细胞重新进入静止期。Aki rin1的这种表达模式与其通过促进融合最终诱导肌管肥大的作用是一致的。同时也说明，在正常的肌肉组织中MSTN参与维持Aki rin1的正常表达，控制肌肉的正常形态。脂多糖处理巨噬细胞后，Akir in1的表达上升，而向培养体系添加重组MSTN蛋白则显著下调其表达水平，MSTN的拮抗剂MSTN-ant1能够解除MSTN对Aki rin1的抑制[1]。这些结果表明，Akir in1参与成肌细胞与巨噬细胞的激活并受到MSTN的下调。

4.2 Akirin1调节肌肉发生相关基因的表达

以前认为，MSTN能够抑制MyoD的表达和活性，控制成肌细胞的增殖速率从而抑制骨骼肌的肥大。MSTN激活smad3信号通路，激活的smad3结合到MyoD启动子上并抑制MyoD的转录进而抑制肌肉分化。除了影响胚胎肌肉发生，MSTN也影响出生后的肌肉发生。最近的研究表明，MSTN和卫星细胞的静止有关，MSTN缺失后会增加卫星细胞的激活并促进肌肉恢复。Akirin1基因将MSTN的缺失和成肌细胞分化的增强这二者联系起来。

4.2.1 Akirin1促进MRFs的表达

在C2C12分化过程中，Akirin1的表达峰值出现时间远早于MyoD，表明Akirin1作用于MyoD的上游。Aki r in1能够特异性地上调细胞周期调节子如p21和p27，并促进p21、MyoD、MyoG以及MHC的表达，过表达Akirin1的细胞系比对照组更早地退出细胞周期。成熟的肌管能够表达MHC，并具有多个细胞核，过表达Akirin1使得肌管出现的时间提前，说明Akirin1在肌管融合时的表达与肌肉分化密切相关。MSTN缺失形成的双肌牛的成肌细胞经诱导形成的肌纤维(DM)比野生型牛成肌细胞形成的肌纤维(NM)表达更高水平的Akirin1，与之相应的是p21、MyoD和MyoG表达水平的升高，其中以p21和MyoD的上升幅度最高，二者的表达峰值在DM中比NM要早。通过RNAi降低Akirin1在C2C12细胞中的表达水平之后MyoD的表达水平也下降，p21和MyoG的表达也随之降低，表明Aki r in1的降低导致了这些肌肉分化标志性分子的下调，从而减缓了肌肉分化的进程[1]。这些结果说明，Akirin1通过上调MRFs促进肌肉分化。

4.2.2 过表达Akirin1降低了Sca-1与CD34的表达水平

C2C12细胞或成肌细胞分化培养时，仍然有一部分细胞保持静止，但是能够自我更新和分化，这部分细胞称为保留细胞。分子和免疫组化研究显示，低水平的Aki r in1和静止的SC相关，而激活的SC则有着高水平的Akir in1表达。Aki r in1能招募更多激活的SC进入分化途径，过表达Akirin1的C2C12细胞经诱导分化后残留的SC数量减少，从而形成比正常肥大的肌管。

静止的保留细胞能够表达SC的标志性分子Sca-1(干细胞抗原)和CD34，启动分化后二者蛋白水平开始下降。Epting等认为，Sca-1的表达能够保持成肌细胞处于缓慢增殖且不分化的状态以产生保留细胞。Sca-1在肌管中的表达水平低于保留细胞，并且过表达Aki rin1的细胞系中Sca-1的表达水平整体上低于在C2C12对照组，其中肌管中降低了60%～70%，静止细胞中降低了40%～50%。另外，通过BrdU标记细胞发现，过表达Akir in1的细胞在分化培养时，BrdU阳性细胞立即显著减少，Akirin1下调Sca-1导致细胞增殖和融合加速，从而促进肌肉分化[11]。

CD34在肌肉中的作用可能是维持一部分细胞不进行分化。Kitzmann等证实了该观点，保留细胞对CD34的表达是异质的[11]。无论处于增殖状态还是诱导分化，Aki rin1过表达的细胞中CD34的总体水平一直低于对照组。Akirin1下调CD34使得一部分细胞对融合和分化信号更为敏感，更容易启动分化。这表明Akirin1可能通过下调Sca-1和CD34这两个干细胞维持分子有效地促使细胞快速退出细胞周期。

5 结语

哺乳动物的肌肉发生一直受到广泛关注，相关的研究主要集中在肌纤维形成和肌肉重生的分子机制上。目前认为，肌肉发生主要受到MRFs、MEF2s、MSTN等转录因子的调控。其中MSTN在肌肉分化中负调控肌纤维的数量和体积以维持正常机体发育所需。Aki r in1作为新发现的MSTN下游基因，由于能够显著促进肌肉分化和重生而受到重视，但是其作用机制尚未完全阐明。未来的研究主要集中于进一步弄清Akir in1的表达模式及是否存在自我调节，Aki r in1在不同细胞中的作用，Akirin1与生长因子之间的关系，Akirin1上下游的转录因子以及相互作用机制这些方面。深入研究Aki rin1不仅可以更加透彻地了解肌细胞生长分化及肌肉形成的分子机制，也可以为临床上肌肉相关疾病的治疗提供理论依据。研究Aki r in1的作用和调控机制也能为转基因动物和分子育种提供理论基础，为生产上提高动物的产肉量提供分子育种的新标记。

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