猪卵母细胞体外成熟的研究进展

刘晓辉,郎洪彦,金海国,罗晓彤,刘 铮,王晓阳

(吉林省农业科学院 畜牧科学分院，吉林 公主岭 136100)

猪卵母细胞体外成熟的研究进展

刘晓辉,郎洪彦,金海国,罗晓彤,刘 铮,王晓阳

(吉林省农业科学院 畜牧科学分院，吉林 公主岭 136100)

综述了猪卵母细胞体外成熟的分子机理和影响因素，以期为后续工作奠定基础。

猪；卵母细胞；体外成熟

卵母细胞体外成熟(IVM)是随着动物胚胎体外生产(IVP)技术的产生和发展而起来的。IVM是体外受精、核移植、转基因等生物技术的重要环节，受到众多因素的调控，其调控机制非常复杂。

尽管猪卵母细胞体外成熟技术至今已经取得了很大的进步，并已经建立了比较完善的体外成熟培养体系，但卵母细胞体外成熟的质量还不够高，达不到大量生产体外胚胎的要求，还有待于进一步完善提高。

1 卵母细胞体外成熟的机理

卵母细胞体外成熟是指在体外特定的条件下，经过一系列生长发育最终形成有受精、胚胎发育能力的过程。卵母细胞的成熟包括细胞核的成熟和细胞质的成熟，核成熟先于质成熟。细胞核成熟包括：卵母细胞恢复减数分裂、细胞核膜破裂、核仁发生致密化、生发泡破裂(GVBD)并发育到第1次减数分裂中期；同时，卵母细胞进一步跨越第1次减数分裂中期，排出第1极体，并停止于第2次减数分裂的中期，直到受精、激活后才完成第2次减数分裂并排出第2极体。细胞质的成熟包括：细胞器的变化和细胞基质的变化。皮质颗粒在胞质合成后，逐渐迁移到质膜下的皮质区。高尔基复合体最初位于核的周围，成熟过程中移向皮质，皮质颗粒完全形成后，高尔基复合体在皮质中消失。发育早期的线粒体为圆形或椭圆形，主要分布于皮质部，卵母细胞成熟后，线粒体又移向核周围，形成幼稚型线粒体。随着卵母细胞的成熟，粗面内质网减少，滑面内质网增多，到成熟晚期，滑面内质网变得很少。胞质成熟的特点就是积累一些稳定的mRNA，并在卵母细胞成熟的一定阶段进行蛋白质的翻译。并且，细胞质成熟与细胞核成熟中有些内容也是相互关联的。有些细胞质成熟过程依赖于细胞核成熟。因此，只有当体外成熟和体内成熟非常接近的生活环境，才能获得较高的成熟率。

核、质的成熟与卵丘细胞的成熟及其卵丘－卵母细胞复合体的发育成熟之间也存在着复杂的相互促进和相互抑制作用。体外培养实验证明，从腔前卵泡来的卵母细胞剥去颗粒细胞或与散在的颗粒细胞共同培养，都不能进行明显的生长[1]。这是由于卵母细胞的生长依赖于与它周围的颗粒细胞之间的缝隙连接所介导的通讯，其生长速度与它周围的颗粒细胞有关[2]。这些虽然被人们所了解，但机理还不是非常清楚，有待于进一步的探索，以使体外成熟效果与体内成熟的效果趋于一致。

2 影响卵母细胞体外成熟的因素

2.1 动物的种类、年龄及健康状况

猪不同品种之间，其卵母细胞质量也存在差异，如瘦肉型猪与非瘦肉型猪，野猪与家猪，外国品种与国内品种。即便是国内不同省份的品种，也可能因遗传背景、特定营养环境、气候条件的不同，导致卵母细胞质量和体外成熟培养的差异。

同一猪种在不同年龄、个体其卵母细胞体外成熟的情况也有所不同。成年期的健康猪体其卵巢表面直径3～6 mm卵泡比例较高，所抽取的卵母细胞胞质均匀、形态完好、裸卵较少，体外培养效果好。初情期前的青年母猪的卵巢卵母细胞体外成熟后可得到后代，但是效率不如成年母猪卵巢体外成熟的卵母细胞，即使是性成熟后还没有怀孕经历。而且，发情周期渐趋正常的青年母猪其卵母细胞在支持后期发育上也比初情期前的青年母猪好[3]。但是，Kuhholzer等体细胞核移植(SCNT)时经产母猪以及初情期前母猪卵母细胞对发育影响不大[4]。

2.2 卵母细胞的分级

包裹在卵母细胞周围的卵丘细胞的层数也影响着卵母细胞的体外成熟。不同的研究者对卵母细胞的分类不尽一致。根据卵母细胞外卵丘细胞的有无和层数，猪卵丘-卵母细胞复合体分5级[5]。A级：扩展且颜色较暗，卵丘细胞有5层以上包裹的胞质均匀的卵母细胞；B级：卵丘细胞颜色较浅且稀疏的，卵丘细胞有5层以上包裹的胞质均匀的卵母细胞；C级：有3～5层卵丘细胞紧密包裹的均匀胞质卵母细胞；D级：卵丘细胞稀少，胞质不均匀；E级：裸卵、黑卵。A、B级可以用于体外成熟培养，一般成熟率较高，而C、D级则效果较差，E级不能用于体外培养。

2.3 卵巢运输

卵巢一般都从离实验室较远的屠宰场获得，要考虑卵巢保存的温度和离体时间对卵母细胞成熟率的影响。Yang等系统进行了运输温度和储存时间的比较，其结果表明，牛卵巢在24℃保存24 h后收集的卵母细胞体外受精后不影响其后期发育[6]。与其他哺乳动物相比,猪卵母细胞对温度特别敏感,卵巢的回收温度较高或较低,卵母细胞体外成熟培养效果极差甚至是退化。较合适的回收温度是32～35℃。当卵巢回收温度低于25℃,猪的卵母细胞将受到冷休克的打击。当回收温度为36～39℃、25～28℃、14～17℃时,猪体外受精的卵裂率分别为52.3%、49.8%和28.8%[7]。Pimprapar比较了把猪卵巢分别放于4℃、15℃、25℃和35℃保存0 h、3 h、6 h和9 h后IVM、IVF，发现在25～35℃保存6 h仍可以有效维持猪卵的发育能力，但是发育率比35℃保存3 h的低。

2.4 生长因子

生长因子对卵母细胞成熟的作用是正向的。发育卵泡中存在多种促生长因子及其受体，它们同时影响卵膜细胞和颗粒细胞的增殖和分化，并参与调节卵母细胞的成熟。颗粒细胞一旦开始增殖分化，就分泌大量的细胞因子,如表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、白细胞介素(IL)、神经生长因子(NGF)、干扰素-r(IFN-r)、抑制素和活化素等，这些因子对卵母细胞的生长起决定作用。在猪的卵母细胞体外成熟培养中，研究较多的就是表皮生长因子(EGF)。EGF是一种卵母细胞成熟的诱导剂，能促进COCs的体外成熟，在COCs上存在EGF受体，随着卵泡的发育表达增强，排卵前达到高峰[8]。EGF能够诱导猪[9]、牛[10]体外培养卵子的卵丘扩散，并促进核成熟。EGF能促进卵母细胞成熟过程中蛋白质的合成，提高卵母细胞质的成熟质量，添加EGF培养成熟的卵母细胞受精后的发育能力更强[11]。另有研究报道，EGF对猪雌性原核形成有促进作用，EGF不但能促进卵母细胞减数分裂，也间接调节卵母细胞浆的成熟。

2.5 卵母细胞成熟促进因子(MPF)

MPF是一种蛋白激酶，由调解亚基细胞周期蛋白CyclinB和催化亚基p34 cdc2两种蛋白组成的复合体，它以非激活的前体物质存在于成熟前的卵母细胞中。Cdc2和CyclinB的变化直接影响到MPF的活性。p34cdc2在无分裂能力的卵母细胞中含量很低，体外成熟后含量则明显提高，这表明卵母细胞成熟分裂能力的恢复与p34 cdc2的浓度有关。CyclinB随着细胞周期的变化而周期性地产生，在分裂间期这种周期蛋白不断积蓄，超过激活MPF的临界值，在分裂后期这种蛋白降解造成MPF复合体的失活。MPF前体转化为MPF需p34cdc2去磷酸化。而CyclinB不仅是MPF的调节亚基，而且还可以直接激活与MPF激活有关的cdc25酪氨酸磷酸酶。此外，CyclinB在激活MPF的同时还激活了p39mos，p39mos控制微管组织中心的变化，影响纺锤体的形成[12]。

2.6 卵泡液

卵泡液是卵母细胞体内发育的介质，含有大量来自血清的生化因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子，对卵母细胞成熟具有重要调节作用。主要表现在提高卵母细胞质成熟的质量，增强胚胎的发育能力[13]。Yoshida等检测出猪卵泡液(pFF)中含有一种分子量介于1万～20万道尔顿的酸性基质,在成熟液中添加猪卵泡液显著提高猪卵母细胞的核成熟率、正常受精率和卵裂率。因此，在卵母细胞的体外成熟培养中，都要添加一定比例的卵泡液，以促进卵母细胞胞质成熟。并且，在体外条件下，pFF能有效降低猪卵母细胞染色体异常的发生率，调解和加速极体排出，使核质成熟趋于同步化。但添加过高则抑制卵母细胞核成熟(Yoshida 等)，成熟液中添加10%pFF可促进猪卵母细胞在体外的核成熟。控制其浓度，一方面消除了对核成熟的抑制作用，另一方面又突出了对胞质成熟的促进作用。

2.7 卵母细胞成熟抑制因子(OMI)

OMI是指卵泡液中能够抑制卵母细胞成熟的物质。OMI是一个多肽，分子量约为1～2 kDa,许多哺乳动物卵巢的卵泡液中均存在，并且在卵母细胞体外培养中可阻止自发减数分裂成熟。目前研究较多的成熟抑制因子有环核苷酸和嘌呤。在体外，通过抑制磷酸二酯酶活性阻止细胞内cAMP降解或是通过激活腺苷酸环化酶升高细胞内cAMP的试剂，都可以抑制卵母细胞的成熟。因此，卵母细胞中的cAMP是控制减数分裂阻滞的重要因子，同时它也能抑制GVBD的发生。有的研究表明,次黄嘌呤(hypoxanthine，HX)是卵泡液低分子量组分中能够抑制卵母细胞成熟的主要成份。猪卵泡液中HX的浓度为1 141mmol/L[14]。HX在(1～6)mmol/L浓度内，能够剂量依赖性地抑制猪裸卵母细胞的自发成熟[15]。HX对猪卵母细胞成熟的抑制作用，与卵母细胞内的cAMP的水平有关。已知cAMP可以抑制卵母细胞成熟，而HX可以抑制磷酸二酯酶(PDE)的活性,使卵母细胞内的cAMP处于高浓度状态,从而抑制卵母细胞成熟[16]。

2.8 激素

激素是哺乳动物卵母细胞成熟的重要物质。目前,绝大多数研究者在卵母细胞的体外成熟培养过程中，添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物。但是，它们在卵母细胞体外成熟过程中的作用及作用机理尚未清楚。根据已有的研究结果推测，激素诱导卵母细胞恢复减数分裂可能通过2条途径：①诱导卵丘扩散使颗粒细胞与卵母细胞的间隙连接中断，使卵丘细胞的信息不能传入卵母细胞，从而解除卵丘细胞对卵母细胞恢复减数分裂的抑制作用，重新启动减数分裂。②诱导卵丘细胞产生一些刺激因子，克服抑制物质的作用而恢复减数分裂。现在，体外成熟培养中，主要以添加LH和hCG为主。Funashi等的研究表明,在猪卵母细胞体外成熟时,培养的前20h加入激素，培养20h后去掉激素,可增加卵母细胞体外成熟率,促进卵母细胞的减数分裂和细胞质成熟。同时指出,在猪卵母细胞体外成熟中,有两个关键步骤是受激素调节的。一是核成熟,它可由培养的前20h加入激素所激发；二是细胞质成熟,在培养的后20h去掉一部分或全部激素可以促进细胞质的成熟[17]。DelosReyes[18]等的研究也发现,在猪卵母细胞体外培养的第2阶段去掉激素可以提高卵母细胞的体外成熟率。

2.9 培养条件

不同动物体外成熟所需的湿度、温度和气相有所不同。不同动物的卵母细胞, 其最适培养温度不同, 人和哺乳动物细胞最适的温度为37℃。猪卵母细胞的体外成熟培养多采用38.5～39℃。对于气相条件，体外培养的COCs所处的环境和体内生理环境大相径庭，而卵母细胞为了更好的生存，必然会调动一些机制来适应体外培养的环境，导致负担增加，也必然影响其最后的成熟。由于体内卵母细胞所处的环境氧浓度比空气中的分压低得多。所以，有人尝试利用低氧分压，在CO2培养箱中培养COCs，CO2浓度为5%。卵母细胞的核成熟受影响不明显，但是体外受精以及孤雌激活胚都得到了很好的后期发育[19]。但是，也有人认为高氧时IVF胚发育较好。因此，有必要进行更深入的研究。

2.10 培养时间

哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时间通常是22～24 h。但猪比较特殊，通常需要44～48 h左右能达到核成熟，24 h时的核成熟率几乎为零。虽然延长培养时间可以使核成熟率逐步增高,但猪的卵母细胞会逐渐老化。因此，在保证一定的核成熟率的前提下，有必要缩短猪卵母细胞体外成熟培养时间。

3 结语

随着猪体外受精(IVF)、核移植(NT)、转基因等生物技术的迅速发展，对卵母细胞的要求越来越大，如何获得大量高质量卵母细胞变得尤为重要。通过超数排卵技术来获取体内成熟卵母细胞不仅数量有限且成本高昂，所以通过屠宰场获取卵巢，抽取未成熟的卵母细胞，经体外成熟培养，不仅仅可以获取大量的卵母细胞，还可以大大降低卵母细胞的成本。但经体外成熟的卵母细胞质量参差不齐，其质量的优劣和成熟率的高低直接影响胚胎后期的发育。要提高卵母细胞发育的潜力，还要依赖卵母细胞体外成熟(IVM)技术的进一步优化。

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S828.3

B

1005-2739（2011）04-0007-05

2011-02-16

吉林省科技发展计划项目《利用体细胞核移植技术生产转基因猪的研究》（20080566）

刘晓辉(1974-),男，助理研究员，硕士。

王晓阳(1956-)，男，副研究员。