壳寡糖分析检测的研究进展

王 礼 邓卫利 林文业

(广西分析测试研究中心，广西 南宁 530022)

壳寡糖分析检测的研究进展

王 礼 邓卫利 林文业

(广西分析测试研究中心，广西 南宁 530022)

壳寡糖是壳聚糖降解后产生的一类可溶于水的氨基糖类化合物，聚合度一般在2～10之间，文中对壳寡糖分析检测方法进行了综述，主要包括比色法，色谱法，质谱法，电泳法等。

壳寡糖；比色法；色谱法；质谱法；电泳法

（一）引言

功能性低聚糖是由2～10个相同或不同的单糖以糖苷键聚合而成，具有糖类某些共同的特性，但不会被胃酸等降解，不在小肠吸收直接到达大肠，具有促进人体双歧杆菌的增殖等生理功能，所以功能性低聚糖又被称为双歧因子。

壳寡糖（chitooligosaccharide，COS）又称低聚葡萄糖胺，低聚氨基葡萄糖等，是功能性低聚糖的一种，是壳聚糖降解后的产物，聚合度一般在2～10之间，是目前自然界中仅知的唯一的碱性寡糖，具有独特的生物活性，如抗菌抑菌；极强的吸湿保湿性；抑制肿瘤细胞（聚合度为6～8时活性最高）；诱发植物的诱导抗病性等，使其在食品、医药、化妆品和农业等方面有广阔的发展前景。不同分子量的壳寡糖，其生物活性差异很大。近年来，壳寡糖的功能研究取得了长足的进步，同时也对壳寡糖的分析测定提出了挑战。文章主要介绍了近10年内壳寡糖的分析测定方法的研究进展。

（二）壳寡糖的分析测定方法研究进展

1.比色法

在初步分析壳寡糖时多采用比色法。邬建敏通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色，确定了甲壳低聚糖平均聚合度及平均相对分子质量。刘琳等利用分光光度法测定壳寡糖平均聚合度，此方法经凝胶渗透色谱验证，能较为准确地判断壳寡糖的平均聚合度。虽然比色法技术简单，对设备要求不高，成本较低，但由于其准确性不高，因此有必要开发一种新的可准确测定壳寡糖的分析方法。

2.色谱法

（1）薄层色谱法

薄层色谱法是在纸层析法的基础上发展起来的，其分辨效率高，分离效果好，简便易行，重现性好，在同一块薄板上可同时分析多个样品。孟显丽，陈国华等通过实验建立了薄层色谱（TLC）分析壳寡糖的条件即最佳的展开剂是乙酸乙酯∶乙醇∶水∶氨水= 5∶5∶4∶0.3，样品上行展距为8cm，采用浸渍法显色。陈小娥，方旭波等通过系统研究，建立了壳低聚糖的薄层-比色分析法，展开剂为正丁醇∶水∶乙酸∶氨水=20∶10∶10∶2；展开温度为25℃，为壳低聚糖的生产和应用提供了一种经济、简便的分析方法。王晓燕，许牡丹等建立的壳低聚糖的薄层比色分析方法是展开剂为乙酸乙酯∶无水乙醇∶水∶氨水= 5∶5∶4∶0.45，采用苯胺-二苯胺-磷酸显色，点样量为2μg/μL，可分开单糖至低聚七糖各组分，斑点圆形、清晰、无拖尾，分离效果好。

薄层层析法虽然可以分析壳寡糖，价格低廉，但此方法操作时间长，只能进行微量生产，无法定量，薄层-比色法可用于壳寡糖常规检验。但是，要大规模地对壳寡糖分离分析还需要不断地寻求新的技术。

（2）高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)

高效液相色谱法（HPLC）是定量分析低聚糖类及其他糖类最常用的方法，具有方便、快速、分离效果好、分辨率高、重现性好和不破坏样品等优点，该方法必须有标准品作参照。由于糖类物质在紫外光区间没有吸收，故无法使用紫外检测器，早期多采用示差检测器来检测糖类物质，但是示差检测器无法进行梯度洗脱，所以检测的聚合度多在8以下，现在多采用蒸发光散射检测器或电化学检测器（脉冲安培检测器），分离柱常用氨基柱或阴离子交换柱。纪莹等通过HPLC法分析检测壳寡糖组分，用TSK-Gel Amide-80柱，示差检测器检测，流动相为乙腈∶水= 37∶63，pH为4.0，柱温为25℃，上样量1μL。李曙光等用Shodex NH2p-50 4E氨基柱，蒸发光散射检测器，使壳寡糖按照聚合度顺序依次被洗脱，检测到的壳寡糖的聚合度范围可达15糖。杨菊林等通过HPLC对不同脱乙酰度的壳聚糖底物经壳聚糖酶酶解后得到的壳寡糖进行分析，条件是：KS2801柱，洗脱液0.001mol/L含0.02%(质量分数)NaN3的NaOH，流速0.5mL/min，柱温40℃，壳寡糖质量分数0.05%，上样量20μL。

阴离子交换柱和电化学检测器配合使用也是壳寡糖检测的一种常用方法，该方法灵敏度高，样品用量少，但仪器昂贵，操作条件比较严格。刘庆生等[11]通过高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)联合使用，直接进行检测低浓度壳寡糖的定量分析，分析了聚合度为1-6的壳寡糖，并且得到清晰的分离峰。这种方法不需要预先衍生就能分析壳寡糖，不仅节约了大量的时间和金钱，而且避免了一些有毒的衍生试剂的使用，减少了环境污染，在组成结构大小上非常相近的单糖也可得到很好的分离，且灵敏度很高，检测限量可达到几十个pg/L水平。

高效液相色谱法虽然效果好，但是它需要大型的仪器，流动相和标准品花费昂贵，对于一般的实验室来说，初期筛选不宜使用高效液相色谱法。

（3）气相色谱（GC）

气相色谱法检测壳寡糖的文献相对较少，朱晓兰，夏文水等采用毛细管气相色谱法（cGC）测定了D－氨基葡萄糖盐酸盐(GAH)，测定结果较比色法准确，但分析步骤比较多且对设备要求较高。

（4）凝胶渗透色谱(GPC)

凝胶渗透色谱法是利用流动相与控制孔径分布的固定相接触从而使溶质按分子体积大小分离的色谱方法。1964年，Moore首先发表了使用GPC方法来测量高聚物的分子量分布，该方法速度快、重复性好。利用GPC数据还可以计算Mw、Mn 和Mz 等平均分子量。这些优点使GPC成为测定分子量分布的主要方法。GPC 测定壳寡糖的分子量可以认为是一个相对值。如果将光散射法与GPC法联用( GPC-LLC)，即可以将相对方法转化为绝对方法。那么，制定易行的可参照的分子量及分子量分布的测定和计算方法是壳寡糖研究领域的一个重要问题。

覃彩芹等用凝胶渗透色谱测定了壳聚糖的降解产物即壳寡糖的分子量，后用凝胶渗透色谱(GPC)和碳-13核磁共振谱(13C-NMR)分析表征甲壳低聚糖。刘羿君等用凝胶渗透色谱法研究了壳聚糖水解过程中的分子量及其分布，制备了不同低分子量的壳聚糖和壳寡糖。

3.质谱法（MS）

质谱法是检测壳寡糖聚合度最有效的方法，可以利用时间飞行质谱（TOF-MS）直接测定壳寡糖的分子量，同时测定壳寡糖是否带有N-乙酰基，也可以利用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析壳寡糖，只是设备的价格限制的质谱分析方法的使用。邵健等在中性条件下采用过氧化氢溶液对壳聚糖进行氧化降解，制备了分子量为l000左右的药用壳寡糖，并用傅立叶变换质谱仪分析表征了产物的结构。李艾华等[21]用Nicolet FT-IR 360 红外光谱仪记录红外光谱，基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析壳寡糖，得到了聚合度3-6的甲壳寡糖。M.Mengíbar等通过MALDI-TOF-MS对壳聚糖降解产物的分析得出壳聚糖酶的作用位点，进而推理壳寡糖的结构。陈勉，朱希强等利用MALDI-TOF-MS方法可以直接检测到壳寡糖的精细结构，聚合度，乙酰基的数量及其剖面图，从而鉴定壳寡糖的质量，为其从健康食品朝病人所需的药品方向发展做出了贡献。

4.电泳法(Electrophoresis)

用电泳法分析壳寡糖的报道不多，采用这种方法难于实现较大规模的分离纯化，它仅仅为我们提供了一条新的思路。20世纪90年代，国外一些科学家通过荧光辅助毛细管电泳法来分析壳寡糖，国内的李邦良等用高效毛细管电泳测定了寡糖的聚合度。王亮等用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析检测壳寡糖组成，能够简单快速有效地定性检测壳寡糖，获得了最佳壳寡糖分析图谱。

（三）展望

随着各种分析技术在壳寡糖的分析测定中的应用，壳寡糖工业不断发展，但还面临着很多理论和实际问题。目前大部分的应用还只处于实验室阶段，而真正可以用于实际样品测定的方法和体系并不多，进一步提高分析的准确性和灵敏度仍是重要的研究课题。总之，尽管壳寡糖的研究面临着重重困难与挑战，但因其发展前景广阔，吸引了越来越多的科研工作者的参与，并且随着各种检测技术的不断进步，其它领域（如纳米科学、超分子科学等）的发展，也必将为壳寡糖的发展带来更多的契机。

[1] Margarete Spindler-Barth，Ulrich Buss.ELISA for determination of chitin and chitosan[M]. R.A.A.Muzzarelli,M.G.Peter.Chitin Handbook,Lyon: European Chitin Society,1997．

[2] 夏文水,刘夏忠,张帆.氨基葡萄糖盐酸盐稳定性及其制备的研究[J].无锡轻工大学学报,1997,16(4):29-23.

[3] 邬建敏.光度法测定甲壳低聚糖的平均相对分子质量[J].化学世界,2001(6).

[4] 刘琳,张杰,李鹏,等.分光光度法测定壳寡糖平均聚合度的研究[J].食品科技,2010,35(9).

[5] 孟显丽,陈国华,孙明昆,等.薄层色谱法分析壳寡糖[J].青岛海洋大学学报,2002,32(4):641-644.

TQ917

A

1008-1151(2011)05-0109-02

2011-02-25

广西区直属公益性科研院所基本科研业务费专项项目（2009ACZ09）

王礼（1964－），女，供职于广西分析测试研究中心，从事分析测试的数据统计工作。