医用臭氧神经毒性作用的研究进展

林小雯 傅志俭

山东大学山东省立医院麻醉科

医用臭氧治疗软组织病变、关节痛和颈、腰椎间盘突出症，收到了良好的治疗效果，对此已有较多报道[1-4]。临床上使用的医用臭氧是臭氧和氧气的混合物，具有强氧化性的臭氧是其有效成分。合理的臭氧浓度、剂量及臭氧与髓核组织的充分接触是取得良好效果的关键[5-7]。椎间盘内臭氧注射，虽然很少发生严重并发症，但医用臭氧硬膜外腔注射过程中可能会误入或渗入蛛网膜下腔[5]，与脑脊液迅速反应，生成的物质可能对中枢神经细胞产生损伤[8]。为此，本文对目前医用臭氧神经毒性作用的研究进展进行综述。

臭氧依靠与生物分子反应生成的活性氧（ROS）和脂质过氧化物（LOPs）产生治疗作用，但是ROS及LOPs若超出了机体的抗氧化能力，就会对机体产生氧化损伤，因此臭氧本身具有细胞毒性和治疗的双重性，在应用过程中稍有不慎就会对机体产生显著的不良反应。Ginannesch[9]等报道了1例L4/5椎间盘臭氧溶盘术后背侧和腹侧神经根受损的病例。同时有报道称长期接触低浓度臭氧的复印工人的神经功能有早期损伤[10]。而国内尚未出现相关的临床报道。

张维[11]等通过鞘内注射不同浓度医用臭氧（30 mg/L、50 mg/L、80 mg/L）对兔行为学和脑、脊髓的超微结构进行了观察，初步评价了医用臭氧是否具有神经毒性作用。将30只新西兰大白兔随机分为5组（n=6），穿刺对照组（s组）仅行小脑延髓池穿刺；纯氧对照组（O2组）行小脑延髓池穿刺后注射医用纯氧2 ml；不同浓度医用臭氧组（O2-O330组、O2-O350组、O2-O380组）行小脑延髓池穿刺后分别注射30 mg/L、50 mg/L、80 mg/L医用臭氧2 ml。分别于麻醉前和注射后24 h测定双前足热刺激缩足潜伏期（PWHL）及机械刺激缩足反应阈值（PWMT），并进行运动功能（MF）评分及后肢趾外展（TA）评分。测定神经行为学的各项指标后处死兔，取大脑枕叶皮质和颈脊髓（C ）组织，透射电镜下观察超微结构。PWHL、PWMT和MF评分是反映动物感觉功能和运动功能的常用指标。TA评分是反映脊髓损伤的灵敏指标，同时考虑到臭氧的氧化作用是瞬间完成的，因此同时选取邻近穿刺部位的大脑枕叶皮质和颈脊髓，观察细胞的超微结构，以便综合评价医用臭氧的神经毒性。

实验结果示：麻醉前及注射后24 h时PWHL、PWMT、MF评分及TA评分组间及组内比较差异无统计学意义（P>0.05）。同时发现不同浓度医用臭氧组大脑枕叶皮质及颈脊髓组织均有不同程度的病理损伤，枕叶皮质的病理损伤主要表现为神经元内线粒体、内质网、核膜及神经突触等结构的损伤；颈脊髓的病理损伤主要表现为神经元和神经纤维等结构性损伤。以上结果表明臭氧对神经元的线粒体有一定的损伤作用，并且随着臭氧浓度的升高呈现逐渐加重的趋势，对神经元的其他结构也产生了病理损伤，提示臭氧对中枢神经具有一定程度的毒性。

为了进一步评价医用臭氧对中枢神经系统的毒性作用，张维[12]等又继续观察了不同浓度医用臭氧对脑脊液超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平的影响，分别于注射医用臭氧前及注射医用臭氧后1 h、2 h、4 h采集0.3 ml脑脊液，测定SOD、MDA水平，并计算SOD与MDA的比值（SOD/MDA）。生存和疾病的痊愈有赖于机体的平衡，氧化/抗氧化平衡是其中最重要的平衡之一。SOD是体内重要的抗氧化酶，可清除过多的氧自由基使机体免受损伤。MDA是体内主要的脂质过氧化产物，其含量变化可间接反映自由基的产生以及膜损伤程度，具有细胞毒性。MDA和SOD分别代表着氧化和抗氧化作用，SOD/MDA可反映二者变化的整体水平。

实验结果示：不同浓度医用臭氧均能诱导兔脑脊液SOD活性升高，清除氧自由基能力增强；30mg/L、50 mg/L医用臭氧可抑制脑脊液MDA浓度升高，对脂质过氧化反应有抑制作用，80 mg/L医用臭氧可升高脑脊液MDA浓度，表明随着医用臭氧浓度的增加脂质过氧化反应增强；SOD/MDA的变化显示30 mg/L、50 mg/L医用臭氧可提高抗氧化水平，80 mg/L医用臭氧可抑制抗氧化作用，提示鞘内注射高浓度医用臭氧有潜在的中枢神经系统毒性。

医用臭氧的神经毒性作用在动物实验上得到了验证，但医用臭氧对细胞的作用尤其是对神经细胞的作用尚不得知，于是本课题组又对不同浓度医用臭氧的细胞毒性进行了研究。

周乃宝[8,13]等用不同浓度臭氧（20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml）对体外培养的星形胶质细胞进行干预，证实臭氧对胶质细胞是否存在毒性作用。体外培养大鼠Ast并行免疫细胞化学鉴定；大鼠Ast传代接种后分为5组（n=7），纯氧组（O2组）加入400 μl纯氧作用20 min后的完全培养基；O320组、O340组、O360组、O380组分别加入400μL的20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml臭氧作用20 min后的完全培养基，分别于2 h、4 h收集细胞悬液及破碎细胞后简易测定法测定细胞SOD、MDA的含量及乳酸脱氢酶（LDH）漏出率，台盼蓝染色计数死亡细胞百分比。细胞膜受损后，细胞内的酶LDH会释放增加，表现为LDH漏出率增加，因此通过细胞培养液LDH漏出率的测定可以较客观地衡量细胞的受损程度。而细胞膜受损后，其通透性发生改变，台盼蓝等染料易穿透细胞膜进入细胞内，使细胞染色，表现为细胞死亡百分比增高，因此细胞死亡百分比是判断细胞受损程度较为简易的指标。周乃宝的相关实验证明：在不同浓度臭氧对体外培养大鼠Ast细胞干预试验中，40 μg/ml组LDH漏出率有所降低（P<0.05），死亡细胞百分比差异无统计学意义（P>0.05），提示细胞未受到损伤。80μg/ml组LDH漏出率、死亡细胞百分比较O3组均明显升高（P<0.01），且4 h较2 h时升高更明显（P<0.05或0.01），提示细胞受到了臭氧的损伤作用，并且这种损伤作用随时间延长而加重。并且在低浓度（20 g/ml、40 g/ml）臭氧干预下，较短时间（2 h、4 h）内检测SOD活力升高，MDA降低；而在高浓度（60 g/ml、80 g/ml）臭氧干预下，短时间（2 h、4 h）内检测MDA升高。

线粒体的功能或结构破坏进而导致神经细胞死亡是许多神经系统疾病共同的致病因素[14]。动物实验研究结果表明，30 mg/L、50 mg/L、80 mg/L的医用臭氧使神经元内线粒体分别出现肿胀、嵴缺失及空泡化等病理损伤，表明臭氧对神经元的线粒体有一定的损伤作用，并且随着臭氧浓度的升高呈现逐渐加重的趋势，对神经元的其他结构也产生了病理损伤，提示臭氧对中枢神经具有一定程度的毒性。这是张维等人观察到的臭氧干预后神经元在电镜下的改变，但也有不同的观察结果。田锦林[15]等将90μg/ml臭氧注入猪蛛网膜下腔后，观察猪的行为学、生化指标及光镜下的脊髓形态均未见异常改变，推测可能是由于动物种属不同、蛛网膜下腔容积不同并且医用臭氧注射浓度和剂量没有可比性的原因，从而造成观察结果的不同。本实验小组的细胞实验结果证明：低浓度臭氧干预下，神经胶质细胞能够中和氧化物质，保证细胞不受损害；而在高浓度臭氧干预下，神经胶质细胞的抗氧化能力达到饱和，不能有效中和氧化物质，细胞受到损伤。

本实验小组通过整体动物和体外细胞实验均证实了医用臭氧具有潜在的神经毒性作用，并且随着臭氧浓度的升高，这种损伤作用更明显。前期实验均证实臭氧的神经毒性可能与其强氧化性有关[8,11-13,16]。在生物体内，LOPs及其产物能破坏细胞膜结构和功能的完整性，不饱和脂肪酸是臭氧作用的靶分子，因此细胞膜最容易受损[14]。已有研究结果证实LOPs直接引起的氧化损伤可诱导细胞凋亡，大剂量则可使细胞死亡。细胞内钙超载是导致神经细胞损伤的主要原因[18-21]。为进一步探讨臭氧的神经毒性作用机制，林小雯[22]等将原代胎鼠脊髓神经元接种于培养皿内，随机分为3组，O3-15组（n=4）和O3-20组（n=8）分别暴露于15 μg/ml、20 μg/ml医用臭氧中，对照组（C组，n=5）暴露于空气中，20 min后采用全细胞膜片钳技术记录细胞膜钙通道的电生理活动。其研究结果表明，在15μg/ml和20μg/ml臭氧作用下，神经元细胞膜上钙离子通道峰值钙电流的电压值向超极化方向分别移动了2.3 mV和2.7 mV，提示低浓度臭氧可使神经元钙通道激活阈值降低且更易激活，这可能是与臭氧增加了大鼠脊髓神经元钙电流密度，且具浓度依赖性和电压依赖性，脂质过氧化产物对钙电流激活过程有明显的促进作用有关。结合本研究结果，推测臭氧引起神经元内某些磷酸去磷酸化或氧化还原的反应，钙通道开放活动的改变可能受这些反应的调控，从而在某种程度上激活了位于细胞膜上的钙通道，使大量钙离子内流，细胞内钙离子稳态失衡，细胞内Ca2+超载，导致自由基产生、代谢酶破坏、细胞膜衰竭、细胞骨架的破坏和线粒体呼吸链中断等一系列病理改变，影响了神经递质的释放、膜内外信息传递、酶活性调节及基因表达，触发了钙离子依赖的级联反应，诱发神经元损伤和死亡[23-25]。这说明神经细胞膜上钙离子通道激活所诱发的钙离子内流增加可能是臭氧损伤神经细胞的可能作用机制之一。

臭氧的浓度难以精确调控使其疗效不稳定，基础研究和循证医学研究不足也是引起争议的重要原因。目前臭氧的最适注射剂量还没有确定，基于安全的考虑，我们建议臭氧的临床使用浓度应控制在30～40μg/m1。30μg/m1的浓度应用于关节腔、硬膜外腔、肌筋膜等软组织时，主要发挥医用臭氧的消炎镇痛作用，40μg/m1的浓度应用于病变椎间盘时，主要发挥医用臭氧的氧化消融作用。然而，根据目前有关臭氧毒性作用的研究，医用臭氧在临床应用的安全性和其神经毒性机制尚有未知。如何正确选择臭氧的临床使用浓度和容积，将医用臭氧更好地应用于临床，进一步规范臭氧疼痛临床的应用还需要大量进一步的研究。

[1] Bonetti M, Fontana A, Cotticelli B, et al.Intraforaminal O2-O3 versus periradicular steroidal infiltrations in lower back pain: randomized controlled study[J].Am J Neuroradiol, 2005, 26(5): 996-1000.

[2] Xiao YY, Meng XD, Li JL, et al.CT guided O3 injection for the treatment of lumar disc herniation[J].Chin J Interv Imaging Ther (Chinese), 2005,2(4): 245-248.

[3] He XF, Li YH, Chen HW, et al.Intradiscal injection of O2-O3 to treat lumar disc herniations: clinical therapeutic effect analysis with 600 cases[J].Chin J Interv Imaging Ther (Chinese), 2005, 2(5): 338-341.

[4] Zhang JS, Xiao YY, et al.Minimal invasive means to the treatment of heriniated disc[J].Chin J Interv Imaging Ther (Chinese), 2005, 2(4): 338-341.

[5] Xiao YY．Meng XD，Li JL，et a1．CT guided Os injection for the treatment of lumbar disc herniation[J]．Chin J Interv Imaging Ther(Chinese)，2005，2(4)：245-248．

[6] He xF，Li YH，Chen Hw，et a1．Intradiscal iniection of 02-03 to treat lumbar disc herniations：clinical therapeutic effect analysis with 600 cases[J]．Chin J Interv Imaging Ther(Chinese)，2005，2(5)：338-341．

[7] He xF，Yu ZJ，Teng GJ，et a1．Treatment of lumbar disc herniation by using percutaneous intradiscal and paraspinal space iniection of02—03 mixture[J]．Chin J Radio1(Chinese)，2003，37(9)：827-830．

[8] Nai-bao Zhou, Zhi-jian Fu, Tao Sun, et al.Effects of different concentrations of oxygen-ozone on rats’ astrocytes in vitro[J].Neuroscience Letters, 2008, 441(2): 178-182.

[9] Ginanneschi F, Cervelli C, Milani P, et a1．Ventral and dorsal root injury after oxygen-ozone therapy for lumbar disk herni~ion [J]．Surg Neurol，2006，66(6)：619-620．

[10] 李国君，肖忠新，褚金花，等．复印室内臭氧污染调查及其对复印工人神经行为的影响[J]．中国现代医学杂志，2001，11(5)：24-26．

[11] 张维, 傅志俭, 谢珺田，等.鞘内注射医用臭氧对兔行为学和脑脊液超氧化物歧化酶、丙二醛水平的影响[J], 中华麻醉学杂志, 2006, 26(6): 552-554.

[12] 傅志俭, 张维, 谢珺田, 等.鞘内注射医用臭氧对兔中枢神经的毒性[J].中华麻醉学杂志， 2007，27(8): 703-706.

[13] 周乃宝, 傅志俭, 孙涛.臭氧对大鼠星形胶质细胞作用的体外研究[J].山东大学学报(医学版), 2008, 46(9): 25-27.

[14] Beal MF．Mitochondria，free radicals，and neurodeg eneration[J]．Curt Opln Neurebiol，1996，6(5)：661-666.

[15] 田锦林，张金山，肖越勇, 等.高浓度臭氧注入猪蛛网膜下腔后对脑脊液和脊髓的影响[J].中国介入影像与治疗学, 2007, 4(4): 310-313.

[16] Mehlman MA, Borek C.Toxicity and biochemical mechanism of ozone[J].Enviren Res, 1987，42(1): 36-53.

[17] Mustafa M G.Biochemical basis of ozone toxicity[J].Free Radical Biol Med, 1990, 9(3): 245-265.

[18] Findel T, Holbrook N J.Oxidants, oxidative stress and the bilolgy of aging[J].Nature, 2000, 408(6809): 239-247．

[19] Hamilton KL.Antioxidants and cardioprotection[J].Med Sci Sports Exerc,2007, 39(9): 1544-1553．

[20] Nie R, Xia R, Zhong X, et a1.Salvia miltiorrhiza treatment during early reperfusion reduced postischemic myocardial injury in the rat[J].Can J Physiol Pharmacol, 2007, 85(10): 1012-1019．

[21] Ikizler M, Erkasap N, Deruek S, et a1.Dietary polyphenol quercetin protects rat hearts during reperfusion: enhanced antioxidant capacity with chronic treatment[J]．Anadolu Kardiyol Derg, 2007,7(4): 404-4l0.

[22] 林小雯, 傅志俭, 赵序利, 等.低浓度医用臭氧对胎鼠离体脊髓神经元钙通道的影响[J].中华麻醉学杂志, 2010,30(10): 1189-1191.

[23] 聂爱芳.焦亚硫酸钠对大鼠海马CA1区神经元钾电流的影响[J].中国应用生理学杂志, 2005, 21(3): 31-32.

[24] 李晓明.L-型钙通道在脑缺血后海马神经元迟发性死亡中的作用[D].广州:第一军医大学, 2003.

[25] Du YF, Sun ZL, Li Y, et al.Effects of H2O2 on L-type calcium current in SH-SY5Y human neuroblastoma cells [J].J Apoplexy Nerv Dis, 2002,19(2): 73-75.