山羊痘病毒属病毒检测技术研究进展

肖 雯 ，聂福平 ，王 昱 ，肖进文 ，李应国 ，刘 力

（1.西南大学动物科技学院，重庆北碚 400715；2.重庆出入境检验检疫局，重庆江北 400020；3.重庆进出口食品安全工程技术研究中心，重庆江北 400020）

山羊痘病毒属（Capripoxvirus，CaPV）包括山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）、绵羊痘病毒（Sheeppox virus，SPV）和牛结节疹病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV），属于痘病毒科（Poxviridae）脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirdae），分别引起山羊痘、绵羊痘和牛结节疹，感染动物表现为发热，皮肤、黏膜、器官表面广泛性丘疹或结节，皮肤水肿，淋巴结肿大，消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡，给养殖业带来较大的危害，造成严重的经济损失，阻碍国际贸易[1-2]。山羊痘最早于公元前200年在欧洲发现，绵羊痘最早于13世纪在英国发现，山羊痘和绵羊痘统称羊痘，是动物痘病中最为严重的一种，发病率50%～80%，病死率20%～80%，其中羔羊致死率可达100%。世界各国均有羊痘发病和流行的相关报道，目前非洲北部、中东和亚洲的部分国家流行较为严重。羊痘病毒可作为生物武器，美国疾病控制中心（CDC）将其划归到Ⅱ类危险病毒。此外，中国、印度、瑞典有人感染羊痘病毒的报道，因此羊痘在公共卫生方面也有要意义[3]。牛结节疹于1929年在赞比亚首次发生，主要分布在非洲，发病率3%～85%，死亡率差异很大，一般为1%～2%，但在某些情况下可达20%～85%，近年来，随着国际贸易的日益频繁，该病在非洲以外地区扩散的趋势。世界动物卫生组织（OIE）将山羊痘、绵羊痘和牛结节疹列为法定通报传染病，我国将山羊痘、绵羊痘列为一类动物疫病[4]。

1 病原学检测技术

1.1 电镜观察

CaPV是一种亲上皮性的病毒，病畜的皮肤丘疹和结节、黏膜、血液、鼻腔分泌物、肺部病损组织和淋巴结内存在大量病毒粒子，可作为病原分离培养的病料标本，切片负染后，直接在透射电镜下观察病毒粒子进行诊断。由于羊痘属三种病毒形态相似，且与正痘病毒也很难区别，需要尽可能多观察以确定病毒形态。该方法检出率低，耗时长，发病区往往无这样的专业设备，难以满足快速诊断的需要。

1.2 病毒培养

CaPV可在山羊、绵羊、牛的组织培养细胞上生长，原代或次代羔羊睾丸（LT）细胞和羔羊肾（LK）细胞最为敏感，尤其是毛用绵羊细胞，也可在某些传代细胞系中增殖，如BHK-21、Vero-E6细胞等[5]。周碧君等[6]研究表明，组织病料对Vero-E6细胞的适应性比对BHK-21细胞要好，前者可用于临床组织样本中羊痘病毒的初次分离。病毒接种后24 h出现细胞病变，3 d后整个细胞单层出现病变，特征为细胞膜收缩并与周围细胞分离，圆化，染色质贴近细胞膜。病毒分离培养特异性较高，但耗时、费力，需要较高的专业知识和技能，因而在应用上受到限制。

2 血清学检测技术

2.1 中和试验（neutralization test，NT）

机体感染CaPV后主要产生细胞免疫应答，仅产生低水平的中和抗体，因此该方法敏感性不高[7]。但是，感染病毒后痊愈的动物在其血清中可检测到较高水平的中和抗体。

2.2 荧光抗体试验（fluorescent antibody test，FAT）

山羊痘病毒抗原可在感染的组织培养破片上进行FAT来鉴定，但该方法操作繁琐，有非特异性反应的问题，难以推广[7]。

2.3 琼脂凝胶免疫扩散试验（agar gel immunodiffusion test，AGID）

AGID最早应用于60年代，可用于羊痘病毒沉淀抗原的检测，后来利用甲硫氨酸对山羊痘抗原进行标记，极大地提高了对山羊痘抗体的检测敏感性。AGID操作简单、需要设备少、价格便宜等特点而得到广泛应用，但其敏感性相对较低，适于基层兽医开展山羊痘病例的诊断[8]。

2.4 对流免疫电泳（counter immune electrophoresis，CIE）

CIE是一种常用的检测抗原或抗体的方法，1988年首次用于检测羊痘病毒抗体，结果显示用灭活的抗原与抗体具有同等的敏感性，与AGP相比，其检出率更高。1999年，Joshi等用生理盐水溶液替代巴比妥缓冲液，改进的后CIE与常规CIE相比，可提高检测的灵敏度。周碧君等[9]研究发现CIE能提高对抗原或抗体的分辨能力，较AGID敏感且速度快。该方法比较简单经济，但需要一定的设备。

2.5 间接血凝试验（indirect hemagglutination assay，IHA）

CaPV本身不能凝集红细胞，因此利用致敏的绵羊红细胞进行间接凝集实验非常有用，如反向被动血 凝 试 验（reversed passive hemagglutination assay，RPHA）主要用于临床痘疹痂皮和感染细胞中GPV抗原的定量测定。IHA用于实验室检测CaPV比AGIDT和CIE更敏感。在各种类型的致敏红细胞中，用戊二醛与鞣酸致敏可大大提高检测的灵敏度，在绵羊痘的诊断中效果较好[10]。

2.6 乳胶凝集试验（latex agglutination test，LAT）

LAT在多种抗体、抗原检测系统中被广泛应用，是一种不需要昂贵的设备，操作简便、快速的检测方法，特别适合在田间和农场使用。1996年，Rao等首次建立了检测羊痘的乳胶凝集试验，其敏感性可与CIE相当。

2.7 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）

ELISA操作便利、快速、敏感、特异性强，便于自动化等优点而被广泛应用。国外已建立了多种检测CaPV抗原或抗体的ELISA方法。Carn[11]建立了用于检测从山羊、绵羊、牛的活组织样品中分离的羊痘病毒的抗原捕捉ELISA方法，适合于组织培养物中的病毒检测。1997年Rao等[12]建立了用于检测皮肤活组织中的GPV抗原的免疫捕捉IC-ELISA方法，特异性80%～100%，敏感性70%～86%，该法不能与绵羊痘区别诊断。1999年Rao等[13]建立了用于检测GPV抗体的Avidin-biotin（抗生素蛋白-生物素）ELISA方法，特异性为91.8%，敏感性为94.1%。然而，目前国内外还暂无牛结节疹ELISA检测方法报道。

P32蛋白抗原在ELISA中反应性好，灵敏度、特异性较AGID高，可进行批量样品的检测，与国际通用的NT比较，有与其他痘病毒也无交叉反应、不需要组织培养条件、检测样本量大、便于推广等优点[11-14]，但是，其跨膜区对细胞有毒性，使其表达量较低，重组P32蛋白很难纯化[15]，而截取跨膜区会对P32蛋白免疫原性有一定影响[16]，因而推广受到限制。目前，P32蛋白的体外表达已成为国际上羊痘研究的热点[17-23]。

3 分子生物学检测技术

随着聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法的日益成熟，该技术已广泛用于病毒的分类、鉴定和疾病诊断。CaPV属于双股DNA病毒，更适于PCR检测[16，23-25]。已报到的羊痘病毒PCR检测方法中，引物多根据编码羊痘衣壳蛋白P32和反向末端重复序列（Inverted terminal repeat，ITR）设计。国外Ireland[24]和Heine等[26]根据P32基因序列设计了相应的引物，建立了检测皮肤样品中羊痘病毒的PCR方法，并利用限制性内切酶做了进一步的确诊。Markoulatos等[25]针对SPV的ITR和α微管蛋白基因设计3对引物，建立了用于检测皮肤组织中SPV的多重PCR技术，该方法敏感性和特异性较好，但偶尔会出现假阴性结果。Hosamani等[27]依据GPV和SPV的P32基因序列的差异，建立了区分山羊痘和绵羊痘的限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法。在国内，郭巍等[28]根据P32基因和α微管蛋白基因序列设计2对引物，建立了山羊痘的诊断方法，扩增出P32基因序列与Genbank上收录的序列同源性达98%。康文玉等[29]依据羊痘 P32基因序列，建立了快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品的实时荧光定量PCR技术。韩若婵等[30]根据P32基因和ITR设计2对引物，建立的多重PCR方法。Stram Y[31]等通过进化树比对分析羊痘病毒基因组末端466 bp片段，建立的半巢式PCR方法，分别与绵羊痘病毒、羊口疮病毒和牛疱疹病毒进行PCR比对检测，该方法检测羊痘病毒的特异性高。

此外，还有针对CaPV其他基因建立PCR方法的研究。如Mangana Vougiouk等[32]基于山羊痘病毒的KS-1和Ins-1基因序列设计引物鉴定了6株在细胞培养物上培养的SPV，能将其与接触传染性脓疱皮炎病毒和疱疹病毒区分开。程振涛等[33]针对山羊痘病毒基因组gp064区域约64 bp的基因片段设计一对PCR引物和一条TaqMan-MGB探针，建立了FQPCR和标准曲线，用该方法对山羊痘临床皮肤痘疹材料和人工感染动物材料进行GaPV核酸检测，为山羊痘临床快速高效地诊断和山羊痘病毒感染羊只的发生、发展及转归研究提供了一种有效的手段。Lamien等[34]根据G蛋白耦联趋化因子受体基因建立实时荧光PCR方法，能对羊痘病毒属进行种属鉴别、定量分析和基因分型。目前还没有基因芯片技术应用于羊痘病毒检测的相关报道。

4 Western印迹

Western免疫印迹是以山羊痘病毒感染的细胞裂解物检查血清样本中病毒结构蛋白的特异性抗体，敏感性和特异性较高，但该方法操作困难、价格昂贵[35]。羊传染性结节口炎病毒高免血清可与一些山羊痘病毒蛋白反应，但不与P32蛋白反应。

5 展望

近年来，我国新疆、甘肃、宁夏、青海、陕西、福建、贵州等地频繁地发生山羊痘和绵羊痘疫情，严重影响国内养羊业的健康发展。我国尚无确切的牛结节疹相关报道，但随着国际贸易日益频繁，近年来该病流行范围有逐渐扩大的趋势。为了降低羊痘带来的巨大经济损失、公共卫生安全问题和严格防止牛结节疹的传入，建立快速高效、操作简便、成本低廉的检测方法具有重要意义。羊痘病毒属间及其与正痘病毒和副痘病毒有相似的血清型，血清学方法难以诊断。分子生物学检测方法的灵敏度、特异性和时效性等优于传统检测方法，进一步研究CaPV基因组特异性强的序列、表达量高的功能基因序列，或一些重要的编码功能的基因，将会为羊痘病毒属的鉴别诊断、预防与控制、流行病学等开辟新的领域。

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