阪崎肠杆菌检测技术研究进展

熊贞兰

南昌市湾里区疾病预防控制中心，江西南昌330004

阪崎肠杆菌（enterobacter sakazakii）曾名黄色阴沟肠杆菌，为肠杆菌科肠杆菌属的一个种。1980年Farmer等[1]发现阪崎肠杆菌和阴沟肠杆菌无论是DNA-DNA杂交还是生化反应以及产生色素上都有很大区别，因此建议将其从阴沟肠杆菌中分出来，命名为阪崎肠杆菌。2007年Iversen等[2]通过基因分析认为阪崎肠杆菌与肠杆菌属有较大差异，建议将其单独成立一个新属，并将新属命名为“阪崎克若诺菌”（cronobacter sakazakii）。

1 传统检测方法的改进

1.1 传统检测方法

传统的阪崎肠杆菌鉴定方法一般是先对样品增菌，划线分离获得单菌落，再进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的生化反应与阴沟肠杆菌相似，应注意区别。

Aldova等[3]评估了从捷克斯洛伐克分离的73株阪崎肠杆菌吐温80脂酶的活性，结果显示97.3%的菌株含有该酶。Postupa等[4]研究了从奶粉和婴儿配方粉中分离到的6株阪崎肠杆菌，发现所有的菌株在25℃和37℃培养7 d后都产生吐温80脂酶。因此，该酶也是鉴定阪崎肠杆菌的一个重要指标。

1.2 分离培养基的改进

美国FDA推荐使用结晶紫中性红葡萄糖胆盐琼脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）分 离 阪 崎 肠 杆 菌，该 菌 在VRBGA平板上生长成黏液状、周边有胆汁酸沉淀的红色菌落。但Famer等[1]发现阪崎肠杆菌在VRBGA上可长成2种菌落，一种是典型的光滑型菌落，容易被接种环移动；另一种是干燥型或黏液状菌落，不容易区分。Muytijens等[5]研究129株阪崎肠杆菌酶谱时发现，129株阪崎肠杆菌都有α-D-葡萄糖苷酶活性，而其它的肠杆菌没有。Farmer等[6]也发现57株阪崎肠杆菌有53株具有α-D-葡萄糖苷酶活性。因此α-D-葡萄糖苷酶可以作为设计阪崎肠杆菌选择培养基的一个工具。

一种方法是把α-D-葡萄糖苷连接上荧光基团然后添加到培养基中，阪崎肠杆菌分解α-D-葡萄糖苷从而释放出荧光基团，在紫外灯下可以清晰判别。Leuschner等[7]在营养琼脂上加入4甲基伞形基-α-D-葡萄糖苷，制成阪崎肠杆菌荧光选择培养基。阪崎肠杆菌在该培养基上生长成产黄色素菌落，在紫外灯下有荧光。不动杆菌属、赫氏埃希氏菌、非脱羧勒克氏菌、聚团肠杆菌等虽然也能在该培养基上产黄色素，但在紫外灯下没有荧光。阿氏肠杆菌和中间肠杆菌有荧光但不产黄色素。从而能把它们和阪崎肠杆菌区分开。但也有例外，伤口埃希氏菌在该培养基上有黄色素也有荧光。Oh等[8]做了进一步的改进，在培养基中除了加入4甲基伞形基-α-D-葡萄糖苷外，还添加了胆酸盐抑制非肠杆菌，加入柠檬酸铁和硫代硫酸钠以区别产H2S的肠杆菌，从而大大提高了选择效果。

另一种方法是把α-D-葡萄糖苷连接上显色底物，制成显色选择培养基。Restaino等[9]设计了一种阪崎肠杆菌选择培养基（ESPM），阪崎肠杆菌在ESPM上35℃培养24 h生长成蓝黑色、无光环、直径1～2 mm的菌落，其他的肠杆菌生长成白色、黄色、绿色菌落。只有索氏志贺氏菌和一株泛菌属生长成蓝黑色到蓝灰色之间的菌落，但很容易通过生化反应把它们和阪崎肠杆菌区分开。该培养基可用于从各种食品中（玉米、小麦、面粉、婴儿奶粉、乳制品、谷类）和环境中分离阪崎肠杆菌。赵贵明等[10]在营养琼脂中加入5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，并添加月桂基硫酸钠做抑制剂，制成显色培养基。阪崎肠杆菌在该培养基上成蓝绿色菌落，其他肠杆菌成白色菌落。但伤口埃希氏菌也生长成蓝色菌落，其与阪崎肠杆菌生化差异很大，容易区分。

2 分子生物学方法

随着分子生物学的快速发展，PCR技术已经广泛应用于各种细菌的检测。PCR技术具有快速、灵敏、特异性好的优点，大大缩短了检测时间。由于对阪崎肠杆菌的基因组了解还不多，用于检测的靶基因还较少，最常用的一个靶基因是16S rDNA。

Iversen等[11]对126株阪崎肠杆菌进行了16S rDNA测序，序列比对分析发现阪崎肠杆菌与克氏枸橼酸杆菌的相似度最高，达到97.8%，超过其他任何肠杆菌。其次才是阴沟肠杆菌（97%）、弗劳地枸橼酸协杆菌（96%）。对其序列进行聚类分析发现分成了4族。110株在1族中，第3族包括5株菌，它们在分类地位上更接近于克氏枸橼酸杆菌、梨褐色叶斑病菌、霍氏肠杆菌，第4族的两株菌和阪崎肠杆菌典型菌株更是只有96.5%的相似性。这些结果表明阪崎肠杆菌的基因多样性和分类学上的复杂性。

Lehner等[12]对13株阪崎肠杆菌分离株和ATCC51329的16S rDNA进行了全长测序，序列与GenBank原有的ATCC29544序列比对，结果发现分离株与ATCC29544相似度在99.4%～100.0%，而ATCC51329与ATCC29544只有97.9%的相似性。构建进化树发现15株菌呈2个基因族，新测序的14株菌在一个族，ATCC51329单独在另一个族。

16S rDNA和16S-23S rDNA的内部转录区（internal transcribed spacer，ITS）序列是细菌分类最常用的部位。根据ITS的长度和序列的变化可以鉴定细菌的种属。刘寅等[13]对阪崎肠杆菌的ITS进行了测序，并进行了序列比对分析，选择特异性区域设计引物，建立PCR检测方法，检测低限达到2.2～5.4 CFU/100 g。随后，他们又选择了ITS的G操纵子作为鉴定目标序列，建立了实时定量PCR检测方法。尽管样品仍然需要预先增菌过程，但整个检测时间在2 d内即可完成，检测极限达到1.1 CFU/100 g。由于G操纵子是多拷贝的（4个拷贝）所以针对它的PCR可以提高敏感性。

Seo等[14]针对阪崎肠杆菌的部分大分子合成操纵子：rpsU基因3’端和dnaG基因5’端设计探针，建立了一个实时PCR检测方法。经68株肠道菌和55株非肠道菌进行特异性评价，结果显示特异性很好，检测极限达到100 CFU/mL。而且该方法不需预增菌，可直接检测奶粉样品，大大节省了时间。

a-D-葡萄糖苷酶活性是阪崎肠杆菌区别其他肠杆菌的一个重要特征，已利用这一特点制备了选择培养基，但选择培养基存在假阳性的问题。Lehner等[15]应用细菌人造染色体技术（bacterial artificial chromosome, BAC）找到了阪崎肠杆菌中a-D-葡萄糖苷酶活性的分子基础，建立了以该基因为目标的阪崎肠杆菌PCR鉴定方法，经63株阪崎肠杆菌分离株和39株其他菌株测试，结果表明该方法特异性很好。值得注意的是，已经知道还有其他的细菌也具有a-D-葡萄糖苷酶活性，并也能在DFI上生长，但Lehner建立的这个以编码a-D-葡萄糖苷酶的基因为基础的PCR方法却没有出现假阳性问题，这一现象还没有确切的解释。

3 其他检测系统

随着分子生物学以及计算机技术的不断发展，出现了一些新的细菌鉴定系统。德国Vermicon公司推出了新产品：VIT细菌鉴定系统。该系统利用16S rDNA的特异性片断制备成基因探针，用于检测食品和饮料中的细菌。阪崎肠杆菌在VIT系统中通过落射荧光显微镜观察呈特征红色，很容易判断。检测极限可达103 cfu/mL。

Iversen等[16]运用人工神经智能网络（artificial nerual networks，ANNs）技术建立了阪崎肠杆菌的一种全新的鉴定系统。将细菌的生化谱和16S rDNA序列输入到系统中，系统可判断哪些是能用于鉴定的核心生化试验与DNA序列，为细菌鉴定所选用的特征提供了依据，降低了假阳性和假阴性的风险。用该系统鉴定了282株菌，其中包括189株阪崎肠杆菌和39株其他a-葡萄糖苷酶阳性的菌株。结果除将2株非阪崎肠杆菌鉴定为阪崎肠杆菌外，其余均正确鉴定，表现了较好的特异性。

虽然阪崎肠杆菌的分离与分子检测技术都取得了长足进展，但研究领域和方法还稍显局限。目前对阪崎肠杆菌的致病机理、免疫反应、基因结构等方面还很不清楚。随着各方面研究的深入，新的分离检测技术会相继出现。

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