生物技术与移植医学的里程碑—羊膜

邵 毅 苗春云 余 瑶

1.南昌大学第一附属医院眼科，江西南昌 330006； 2.江西瑞济生物工程技术有限公司，江西南昌 330012；3.南昌市第三医院，江西南昌 330009

随着现代医学和循证医学的出现，社会经济及现代科技的进步，需要组织移植的患者逐年递增，羊膜的开发和应用也以螺旋式向前发展。现今成熟而现代化的组织制备技术，使羊膜材料性能不断提高和改善，羊膜移植技术从基础研究深度、手术技巧、手术器械到仪器设备都得到了快速发展，众多患者得益于各种羊膜材料的应用，各种创伤性疾病得到了有效、及时的治疗而得以恢复。随着羊膜移植手术的日臻完善，人们对术后生活质量和舒适度的要求亦日渐提高，手术的目的已从仅是恢复功能向个体化手术转变，个体化羊膜移植手术已是整个羊膜移植手术发展趋势的必然结果。

1 羊膜的特点

人羊膜是从细胞滋养层衍化而来，是两层胎膜的内层。正常羊膜薄而透明，无血管、淋巴管，厚度为0.02～0.05 mm。光镜下羊膜分上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维母细胞层、海绵层，而现在临床移植所用的羊膜组织通常只含有上皮细胞层、基底层和致密层结构。根据羊膜生物活性成分研究现状，按性状和作用分为3大类：基质成分、生长因子和酶类。基质成分主要包括胶原、层粘连蛋白（LN）；生长因子主要有表皮生长因子、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、TGF-α，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3等及其相应的mRNA；酶类则包括基质金属蛋白酶、神经营养因子（神经营养素、神经细胞分裂素、 成纤维细胞生长因子、胶质源性神经营养因子、胰岛素样生长因子等）、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白酶、α2-抗糜蛋白酶等。羊膜不表达人类白细胞抗原（HLA）-Ⅱ类抗原，含少量的HLA-A,B,C和DR抗原以及β2-微球蛋白，抗原性极低，用于异体移植时一般不产生排斥反应。

2 羊膜的采集与标准

适龄健康剖宫产妇，取产后2 ～ 4 h胎盘。全身细菌性、病毒性或真菌性败血症或脓毒血症；病毒性肝炎；狂犬病；婴幼儿先天性风疹；怀疑或确诊病毒引起的中枢神经系统疾病；与病毒感染有关的恶性肿瘤；严重宫内或产道感染；母亲或胎儿患先天性或遗传性疾病；AIDS病均视为供体羊膜采集的绝对禁忌证。

3 羊膜的分类和作用

目前羊膜主要有固体羊膜和液态羊膜两种，固态羊膜又分为新鲜、冷冻、冷冻干燥、生物复合型及药物羊膜等，而液态羊膜目前主要有羊膜上清液、羊膜提取液等。羊膜具有促进细胞增殖和迁移、抑制炎症和新生血管、逆转上皮鳞状化生[1]、减轻纤维化的作用，此外羊膜还具有抗微生物特性、抗凋亡作用和免疫调节作用。

4 羊膜的特性研究

目前，羊膜已作为细胞培养载体、分子生物筛、膜控释药系统等广泛应用于基础研究。科学家们利用羊膜上培养角膜、各种黏膜细胞用于眼表和口腔重建，在羊膜上培养神经细胞修复神经缺损，培养表皮细胞及其前体细胞用于表皮重建，培养软骨细胞修复软骨缺损，培养成纤维细胞修复肌腱，培养膀胱细胞用于膀胱重建等。此外，还可通过培养多种胚胎和成体干细胞用于组织和细胞重建。羊膜由于致密层和海绵层胶原纤维形成的分子筛立体构型，能通透多种中小分子，可以作为多种药物的分子生物筛。此外，羊膜还能通过生物学改良的方式成为良好的药物载体，能容纳大量药物分子，并随着羊膜的缓慢降解在较长时间内逐步释放，维持局部有效药物浓度，成为良好的膜控半定量释药系统。

羊膜活细胞制品是从羊膜中分离出细胞成分，经过一定的培养或分化制成具有多种用途的生物制品，可供分离的细胞包括羊膜上皮细胞及羊膜间充质干细胞。人羊膜上皮细胞是胎盘羊膜经胶原酶和胰蛋白酶消化后获得的，具有眼表重建的潜在运用价值。此外，分离的羊膜上皮细胞通过5-氮杂胞苷和抗坏血酸磷酸盐诱导后，表达心肌特异性转录因子Nkx2.5mRNA和GATA-4mRNA，可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞。此外，羊膜上皮细胞还有助于阻止药物导致的肺损伤。近年来，许多研究表明羊膜上皮细胞可合成和分泌多种神经递质及神经营养因子，使其有望成为神经损伤后细胞治疗的来源之一，将其移植入脊髓损伤部位后可以存活至少3周并在移植部位有明显迁移。而从人羊膜中分离的间充质细胞具有干细胞特性，可分化成心肌样细胞、脂肪细胞、神经细胞、心肌细胞、脑细胞等和成骨细胞等，可作为组织工程种子细胞的新来源。并与纤维蛋白胶结合，可用于神经替代、心肌梗死、糖尿病、骨组织工程、整形外科等治疗，是目前细胞替代治疗的新途径。

5 羊膜的应用研究

人羊膜含有胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分,表达多种生长因子及其mRNA的相关蛋白,能为细胞的增殖、分化提供丰富的营养成分,有利于细胞的生长繁殖；基底膜较厚,有利于上皮细胞的贴附和移行,促进上皮化,防止其凋亡；组织相容性好,不表达人类白细胞抗原,羊膜异体移植后不诱导排斥反应；容易得到,且可塑性好,易于加工处理。所以,人羊膜是组织工程支架的理想材料，在临床上有良好的应用前景。目前，羊膜已作为胶原纤维支架、生物敷料、植入材料、 黏膜替代材料等，通过覆盖、移植、填充或成分吸收，广泛应用于眼科、皮肤科、口腔科、脑外科、烧伤外科[2]、整形外科、泌尿外科、血管外科、妇科、腹部、骨盆和耳鼻喉手术等重建黏膜、血管、肌腱和皮肤组织。

5.1 羊膜在眼科的应用

羊膜被认为是组织工程角膜上皮的最佳载体。目前，羊膜不仅作为细胞支架应用于重建眼表，包括结膜大面积缺损、角结膜烧伤、睑球粘连[3]、翼状胬肉、角膜穿孔等，还可以联合角膜材料用于各种营养性、真菌性、大泡性、蚕食性角膜溃疡及角膜迷离瘤、角膜原位癌等多种肿瘤，同时，还作为机械阻隔材料广泛应用于青光眼、鼻泪管阻塞、斜视、泪道重建和封闭视网膜裂口。此外，何伟[4]将其用作泪道栓子材料治疗干眼和通过体外培养人视网膜色素上皮细胞进行视网膜移植。笔者的最新研究成果显示，羊膜还可以逆转结膜鳞状化生，用于中重度干眼和Stevents-Johnson综合征等疾病的治疗[1]。

5.2 羊膜在口腔科的应用

羊膜作为生物敷料治疗口腔糜烂，具有促进新生毛细血管形成、加速表层黏膜生长作用，减少体液丢失，控制并防止细菌污染创面，起到生物敷料屏障作用，用于唇黏膜糜烂、口腔黏膜烧伤治疗，疗效显著[5]。羊膜覆盖于硬组织表面可以成活，促进牙龈上皮、肉芽组织、胶原蛋白的形成，具有成血管作用，可用于牙龈缺损修补、前庭黏膜修补和口腔组织重建。羊膜具有的抗瘢痕纤维化功能，能减少瘢痕形成，可用于口鼻瘘修补及腭部软组织缺损[6]。

5.3 羊膜在脑外科的应用

人羊膜是生物相容性良好的半透膜,含有多种促进神经再生的成分,其中LN 一直被认为是最有效的神经生长促进因子。研究发现LN22 （α2、β1、γ1）和LN28（α4、β1、γ1）对于出生后神经发育和损伤后轴索再生非常重要。有学者将羊膜细胞外基质制成结缔组织，基质薄片制成神经导管，用于修复坐骨神经缺损，效果显著。此外，羊膜还可作为生物敷料应用于硬脊膜损伤修复、创伤性脑损伤和癫痫的治疗。羊膜上皮细胞还可用于帕金森病和脊髓损伤的治疗。有学者发明了一种人造硬脑膜，是在人羊膜层上粘合着小肠黏膜下层，所组合成的“脑膜”具有人体硬脑膜的机械抗张能力和蛛网膜的抗粘连的双重功能，易于与硬脑膜等修补缝合，密封性好，生物相容性好，与正常组织愈合良好，还可用于胸膜、腹膜等缺损修补，适用范围广。另有学者采用慢病毒载体转染的方法将外源性基因转入人羊膜细胞，将其移植入脑内发现对脑缺血性疾病有明显的治疗作用[7]，这一成果为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的治疗途径。

5.4 羊膜在皮肤科的应用

以人羊膜为支架,骨髓间充质干细胞和表皮细胞作为组织工程种子细胞,共同移植修复开放创性皮肤损伤创面,有较好的促愈合效果，可重建皮肤缺损的表皮。此外，羊膜的多种生长因子还能促进糖尿病难愈性皮肤溃疡的愈合，有很好的促修复和抗瘢痕效果。此外，皮肤湿疹、皮肤烧伤、放射性皮炎、天疱疮又是羊膜移植很好的适应证。

5.5 羊膜在骨科的应用

研究显示，较强的抗炎、抗瘢痕作用使羊膜在关节腔形成术、开放性骨折、骨干骨折术后发挥着良好的作用；羊膜表现的良好的吸水性、细胞吸附性和体外生物相容性,能使髁突细胞可在其上黏附、增殖,因此适于作为髁突组织工程支架材。此外，应用羊膜为载体养游离软骨细胞修复软骨缺损,术后软骨缺损区新生了透明软骨。

5.6 羊膜在泌尿外科的应用

应用羊膜作为支架,恢复狭窄或者缺损的尿路;或在羊膜上培养尿路上皮细胞再移植回体内代替缺损的泌尿器官，是近年来泌尿外科学者研究热点之一。早在1987年, Fishman等[8]将人羊膜用于狗膀胱的重建。学者将老鼠的尿路上皮细胞培养于人羊膜发现羊膜上的尿路上皮生长良好，并将其移植回老鼠体内发现可形成有功能的膀胱。此外，羊膜移植可用于男性尿道狭窄、瘢痕性尿道闭锁和大段输尿管缺损的治疗。

5.7 羊膜在肌腱粘连的应用

细胞外基质作为分子生物材料屏障能有效预防跟腱黏连，一直被认为是一种较为理想的预防跟腱黏连的生物材料。羊膜中丰富的营养因子和较强的抗炎作用使羊膜在修补受损肌腱和构建组织工程肌腱中发挥了一定的作用。以成纤维细胞为组织工程种子细胞,选用羊膜细胞外基质作为负载细胞的材料,能修复部分跟腱缺损 ,可作为肌腱修复的一种选择方法。

此外，羊膜还可用于十二指肠及肛管上皮缺损、血管重建，阴道修补、鼓膜成形及穿孔修补等，是目前良好的生物修补材料之一。

目前国内正式生产厂家不多，各医院临床所用羊膜均为自行剥制的新鲜羊膜，但有一定的局限性，如手术受羊膜来源的限制，必须低温保存，时间短，临床使用不方便，且存在法律风险、不能保证随时供应、质量无法保证等。羊膜生产实现了工业标准化后，通过冷冻干燥技术、60Co辐照灭菌，解决了常温保存、常温运输，使用方便，为实现羊膜的普及应用奠定了基础。药物羊膜、凹凸羊膜和个性化羊膜等各种新型生物羊膜制品是人们根据羊膜的特性研发出来的、适用于各类生物医学领域的羊膜产品。相信通过今后各种技术的完善与改进，羊膜及其制品将会对医学特别是眼科学的发展起到更加重要的作用。

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[8] Fishman IJ, Flores FN, Scott FB, et al. Use of fresh p lacental membranes for bladder reconstruction [ J ]. J Urol, 1987, 138 （5）:1291-1294.