小麦抗赤霉病育种研究进展

李小勋,顾乃杰,张玉松

(沧州市农牧局 ,河北沧州 061001)

小麦赤霉病 (Head Scab)是由多种镰孢属(Fusarium graminearumSchw)真菌侵染小麦而引起的一种流行性病害。该病遍及全国,一直是淮河以南及长江中下游麦区发生最严重的病害之一。近年来,在黄淮海平原麦区、西北麦区和东北春麦区也多次发生大流行,造成很大损失。在美国,赤霉病已成为最严重的小麦病害,几乎每年都在美国的一些地区造成严重危害。过去10年间,赤霉病在伊利诺州、印第安纳州、密执安州、明尼苏达州、北达科他州、俄亥俄州和南达科他州暴发,造成的损失超过 10亿美元[1]。小麦感染赤霉病后,不仅使单产下降,影响子粒品质和加工品质,使商品价值降低,病粒失去种用和工业价值,而且由于病菌的代谢产物含有毒素,人畜食用后还会中毒。尽管药剂防治有一定效果,但选育抗赤毒病新品种仍是克服小麦赤霉病的根本途径。自20世纪50年代开始,中国学者就针对小麦赤霉病病原菌的致病菌种、致病性及抗性鉴定技术、抗源筛选和抗赤霉病性遗传、育种等方面做了大量研究。本文从赤霉病病原菌生理特性及分化、抗病机制、抗源筛选和鉴定、抗病基因的分子标记和克隆以及抗赤霉病育种 5个方面概述中国小麦抗赤霉病育种研究进展,探讨目前小麦抗赤霉病育种中存在的问题,并对其发展前景进行展望。

1 赤霉病症状、病原菌及生理特性分化

1.1 赤霉病发病症状

小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌侵染引起。该病菌寄主很多,除小麦外,还侵染水稻、玉米、麻、棉、甘薯等作物。为害小麦的赤霉病病菌主要来自土表的带菌作物和带菌植物残体。赤霉病从小麦幼苗期就可发病。根据为害时期和为害部位的不同,分别有苗枯、基腐、穗枯、种子霉烂等症状,其中以穗枯危害最大。

(1)穗枯。在小麦开花和乳熟期发生。初期在小穗颖片基部出现水渍状淡褐色病斑,后逐渐扩大至整个小穗,呈枯黄色。潮湿时,在颖片合缝处或小穗基部长出粉红色胶质霉层(病菌的分生孢子),后期在病部密生许多小黑粒(病菌的子囊壳)。病重的麦粒皱缩、发霉、空瘪。

(2)苗枯。苗枯是由于种子带菌或土壤里的病残体带菌引起的。感病较重的种子常于出土前腐烂,病轻的虽能出土,但芽鞘受害会变褐腐烂,扩展至根及子叶也变褐,导致麦苗枯死。病部长出粉红色粘质霉层。春麦区易发生苗枯。

(3)基腐。各生育期均可发生。发病初期基部变褐色,后期腐烂致植株枯萎死亡。

(4)种子腐烂。收割后如不及时脱粒或不及时晒干而堆放时,病害还可以继续传染危害,使更多的麦粒变粉红色霉烂,并长出小黑粒。

1.2 病原菌

自从 1823年施韦尼兹(Schweinitz LD von)在美国的玉蜀黍上发现此病以来,国内外的科学工作者对此病的病原菌作过大量的研究。在美国,Dickson调查研究认为 98%是玉米赤霉菌 (Gibbrella zeae),其无性阶段为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)。在欧洲,优势种有两种:禾谷镰刀菌和黄色镰孢菌(F.culmorum)[2],F.culmorum主要发生在较凉爽的中北部,而F.graminearum主要发生在温度较高的南部及美国。在非洲南部,Boshoff等用同工酶电泳分析了采自不同田块的小麦赤霉病病菌,认为引起小麦赤霉病的病原菌主要是禾谷镰刀菌二组 (F.graminearumGroupⅡ );其次为燕麦镰孢菌 (F.avenaceum(Fr.)Sacc)、锐顶镰孢菌 (F.acuminatumEll.et Ev)、三 隔镰孢菌 (F.tricinotum(Corda)Sacc)、串珠镰孢菌 (F.monili f ormeSheldon)等。此外,木贼镰孢菌 (F.equiseti(Corda)Sacc.)、茄病镰孢菌(F.solani(Mart.)Sacc.)、黄色镰孢菌 (F.culmorum(WG Smith)Sacc.)等虽自病穗上分离到,但致病力不强,只引起颖壳边缘变色。禾谷镰刀菌的有性世代为玉米赤霉菌(Gibberella zeae(Schwenitz)Petch.)。

1.3 生理特性及分化

赤霉病菌对温度的适宜范围很广。菌丝发育适温为 22～ 28℃ ,最低温度为 3℃ ,最高温度为 35℃;分生孢子萌发的温度范围为4～ 32℃,以 28℃最为适合。分生孢子萌发要求很高的湿度条件,相对湿度 96%方可萌发,以在水滴中萌发最好。在高湿条件下,萌发速度与温度有关,25～ 26℃水滴条件下经3 h即可萌发,低于4℃萌发速度缓慢,高于37℃则不萌发。子囊孢子的萌发温度范围为 4～ 35℃ ,最适温度为 25～ 30℃ ,低于 3℃和高于37℃时都不能萌发。在自然条件下分生孢子形成的最低温度为8℃,适温为25℃;子囊壳形成适温为15～ 20℃ ,成熟的最低温度为 10～ 12℃。商鸿生等[3]报道,在18～ 20℃条件下,相对湿度低于95%子囊孢子不能释放;相对湿度达95%以上时开始有少量释放,饱和湿度下释放量最多。子囊孢子对低温的抵抗力很强,在我国东北及西北各地,病残体上子囊壳内的子囊孢子均能顺利越冬。带菌残体内的菌丝体不论在室内和室外土表都能存活一年,越冬越夏后只要未腐烂仍具有产生子囊壳的能力。病种子内的菌丝体可存活数年之久。但是,经过大量的研究发现,赤霉病菌很容易发生变异,变异主要表现在培养性状产毒能力和毒性水平等方面。实验室在人工培养或0～ 4℃长期保存的情况下,赤霉病菌的培养性状和毒性很容易发生变异。而且,采自不同地方麦穗上的病原菌致病力不同,有时同一地方不同麦穗上的病原菌致病力也不同。王芊等[4]利用采自黑龙江省不同地区的赤霉病菌种标样对小麦品种的致病力差异进行了初步试验,结果表明,不同来源的赤霉病菌种对同一品种的致病力是不同的。国外关于赤霉病菌的变异也有大量的报道[5～7]。

2 抗病机制

小麦对赤霉病的抗性有两种机制——抗扩展和抗侵入。抗扩展主要表现在病原菌侵入后在病穗上扩展的快慢和多少。一般情况下,抗扩展在抗性表现中占多数,在有利于病害发生的条件下,抗侵入不很明显,抗侵入一般与穗部的表面结构和外部形态有关[8]。于泉林等研究了不同抗赤霉病类型品种的病理解剖学,发现抗病品种穗轴维管束数量比感病品种的多;穗轴节上部的节间组织排列较下部节间组织致密;菌丝体只存在于穗维管束的导管内,并且抗病品种内的菌丝体数量比感病品种数量少、且发育不良;感病品种穗轴组织的坏死速率为抗病品种的 7倍。 Karina等[9]研究了赤霉病菌侵入后抗感品种小穗的组织病理学变化,结果与前面相似。王雅平等[10]研究测定了13个抗赤霉病性有明显差异的小麦品种的病小花数、超氧化物歧化酶(SOD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性,以及胆碱、总酚、水溶性蛋白、黄酮和木质素的含量。结果表明:健株的 SOD活性与小麦抗赤霉病性呈极显着正相关,与胆碱含量呈极显着负相关,接种 24 h的 PAL活性,72 h黄酮含量,168 h木质素含量与抗赤霉病性呈极显着的负相关,总酚、水溶性蛋白质含量在不同品种间达极显著差异水平。陈利锋等[11]用禾谷镰孢 JF-12菌株的子囊孢子悬浮液于抽穗期对望水白、扬麦 4号和宁麦 6号等不同程度抗赤霉病的小麦品种进行接种,比较了接种后不同时间穗组织中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活力变化。结果表明:接种后抗病品种望水白 SOD活力下降,且一直处于较对照(未接种)低的水平;中抗品种扬麦 4和感病品种宁麦 6号的SOD活力初期略有下降,但很快明显升高并显著高于对照;而抗病品种的CAT活力则始终高于对照。此外,黄丽华等研究了不同抗赤霉病品种抽穗期穗部的总酚含量和初花期穗部多酚氧化酶活性与小麦抗赤性的关系。李祥义等报道,盛花期胆碱浓度与赤霉病的抗性呈显着负相关。王广金[12]、陈耀锋等[13]报道,苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性与品种的抗性呈负相关。自从Miller等提出小麦对赤霉病的第三种抗性—毒素的降解以来,国内外学者进行了大量的研究,都证明赤霉菌毒素(DON)可使小麦组织受到与病菌侵染一样的损伤,产生同样的变化,品种对其的敏感性与田间抗性呈负相关,因此可用赤霉菌毒素筛选抗赤霉病细胞突变体。刘宗镇等对DON在小麦抗赤性的细胞、组织、生化机制等方面作了较系统的研究,发现DON对小麦愈伤组织诱导和分化的类生长激素作用。在小麦愈伤组织的诱导和分化过程中,DON高浓度起严重抑制作用,而低浓度却促进再生植株生长。高浓度DON抑制植株K+吸收,导致叶肉原生质体质膜损伤而失活,抑制黄化芽鞘的生长;低浓度DON则能促进K+吸收,提高原生质体的存活率,促进黄化芽鞘伸长。姚泉洪等研究发现,抗赤霉病小麦品种苏麦 3号、繁 9能转化镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)成产物 X,而感病小麦品种宁麦6号、徐州21无转化能力。产物X对小麦黄化芽鞘的伸长生长无抑制作用,对禾谷镰刀菌分生孢子的萌发有明显抑制,说明抗性小麦品种对赤霉病菌毒素的脱毒是小麦重要的抗赤霉病机制。Mesterhazy(1995)又提出第四、第五种抗病类型,分别为对麦粒侵入的抵抗和耐病性。

3 品种资源抗病性鉴定和筛选

3.1 抗病性的鉴定

小麦品种抗赤霉病的鉴定是抗赤霉病遗传育种的重要环节,关系到育种工作的成效。目前鉴定小麦抗赤霉病的方法主要有三大类:即人工接种鉴定法、田间自然鉴定法和生理生化鉴定法[14]。人工接种鉴定可较准确地反映品种的抗性但准确度不及田间诱发鉴定;田间自然发病可准确反映品种本身的实际抗性水平,但易受环境条件的影响,在发病低的地区不能反映品种的实际抗性,同时,这两种鉴定方法,鉴定过程周期长、效率不高。相比之下,生理生化鉴定,特别是利用病原菌毒素能快速鉴定小麦品种对赤霉病的抗性。刘新琼等以赤霉菌毒素对不同小麦品种的胚根、胚芽的生长抑制率和胚根细胞膜的损伤度为指标,研究了小麦品种抗赤霉病与抗赤霉菌毒素能力之间的关系。结果表明,抗病品种抗(耐 )毒素能力强,感病品种抗(耐 )毒素能力弱,中抗、中感品种的抗(耐)毒素能力居中,表现小麦品种的抗病性和抗(耐)毒素能力之间呈明显的正相关性。这一结果在小麦品种的抗赤霉病性鉴定方面具有良好的应用前景。但此方法也有缺点,用于处理的赤霉菌毒素浓度难以确定,不容易规范化。最近,美国科学家Bushnell将抗赤霉病的基因和另一个引起植物产生花青甙的基因连锁在一起,含有合成花青甙基因的细胞变红,该基因射入植物组织后,当植株组织接种镰刀菌并在显微镜下观察时,这种特殊的颜色能够快速简便地分辨这些关键细胞的存在,表明它们可能带有潜在的抗赤霉病基因,利于快速的鉴别抗性。

3.2 抗源的筛选

在抗源筛选方面,方毅敏等[15]自1984年承担全国小麦育种攻关中的小麦抗赤霉病性鉴定任务以来,对来自全国 10个麦区的12 648份小麦育种材料抗赤霉病性进行了田间自然鉴定。结果表明,至今仍未发现免疫的小麦材料。长江中下游冬麦区、华南冬麦区及东北春麦区的供鉴小麦抗性较强,全国 R级小麦材料均分布在这些赤霉病频繁流行的麦区;西南冬麦区、黄淮冬麦区及北部春麦区的供鉴小麦抗性最差。我国现有小麦材料的抗病性与丰产性仍存在较大矛盾,至今仍缺乏可应用的材料。但在筛选方法上有了较大的改进,除用常规的抗性鉴定筛选方法外,新的生物学方法、细胞学方法以及分子生物学技术方法等在赤霉病的抗性鉴定与抗源筛选、特别是抗性突变体的筛选方面发挥了较大的作用。如孙光祖等[16]利用辐射诱变、组织培养和细胞筛选相结合的方法选育出了抗赤霉病突变体92K809。该突变体不仅抗赤霉病能力强,且抗性稳定,同时具有优良的农艺性状,比原亲本增产 4.9%。经RAPD技术检测,所用的 128个引物中有 1个引物(OPY15)在抗病突变体 92K809和赤霉病抗原苏麦 3号中得到了相同的扩增产物,初步认为该片段与赤霉病的抗性有关。孙光祖等利用辐射与离体培养、细胞筛选相结合的方法进行抗病突变体的筛选,选育出 4个抗赤霉病的突变体。经多年田间接种鉴定和考察,突变体的抗病能力较亲本提高 1级,株高、穗长和小穗数等主要农艺性状也发生了变异。突变体与其亲本相比,醇溶蛋白电泳和过氧化物同工酶酶谱带数、谱带强度和谱带位置都有差异。超氧化物歧化酶的活性分析表明,在毒素作用下,突变体的酶活性比亲本高 8.61%～24.14%,突变体具有较高的超氧化物酶活性。此外,阎博等以不同小麦品种(系)幼穗诱导的愈伤组织进行小麦抗赤霉病体细胞突变体筛选也表明,不同赤霉病抗性品种(系)对赤霉菌毒素表现出不同的反应,抗性品种愈伤组织生长受毒素抑制小,感病品种愈伤组织受毒素抑制强烈,筛选出了赤霉病菌毒素加入的最适浓度为 2%(V/V),在该浓度下可筛选出抗性突变体,获得了咸农 151,陕 167,陕 229等品种(系)的赤霉病毒素抗性体细胞无性系再生植株。再生植株田间人工接种鉴定表现出中或高的抗性。

4 抗病基因的标记和克隆

20世纪 80年代以来,随着 RFLP,RAPD等一系列分子生物学研究方法的出现,生物学的研究进入了分子时代,小麦赤霉病的研究也不例外。因此,寻找抗赤霉病连锁标记以及应用于基因定位、建立分子标记辅助育种体系来提高抗赤霉病育种效率,具有重要的理论和实践意义。 Leissner等用 AFLP鉴定了引起小麦赤霉病的F.graminearum的 18个菌系,其中 15个表现出高度的相似性,另外 3个与F.graminearum图谱完全不同。Nicholson等(1998)用 RAPD鉴定了F.culmorum与F.graminearumPCR扩增产物的特征,并选择片段克隆、测序,设计的引物能够用常规 PCR鉴别两种赤霉菌。 Nakamura等[17]用 RFLP构建了引起小麦赤霉病的镰刀菌的线粒体DNA的物理图谱,利用此图谱可以鉴定不同的镰刀菌以及对这些镰刀菌线粒体DNA多态性的进一步研究。另一方面的研究表现在小麦赤霉病抗病基因的定位以及抗病基因的检测等方面[18,19]。国内陆悦健[20]用真菌β-微管蛋白基因的通用寡聚核苷酸引物B1和B3,扩增并克隆了一段821 bp的小麦赤霉病菌F.gramineaum的β-微管蛋白基因片段,并进行了序列测定。根据该序列设计了F.graminearumβ-微管蛋白基因的抗药性测序引物,测定了赤霉病菌对多菌灵不同抗感菌株的β-微管蛋白基因核苷酸序列。在抗赤霉病基因工程方面,我国南京农业大学和江苏省农科院运用基因枪和农杆菌介导的方法将抗性基因导入水稻,并获得了转基因植株,有待进一步进行抗性鉴定。

5 小麦抗赤霉病品种选育方法

5.1 系统选育

由于中国许多地区都有赤霉病发生,存在着自然选择压力,通过单株选择,筛选出不少抗病的地方品种[21],主要有望水白、平湖剑子麦、翻山小麦等。这些农家品种的抗性强且持久,成为抗病育种的重要抗源。也从推广的感病品种中选育出了一些较抗(耐)病品种,如从南大2419中选育出万年2号,从阿夫中选育出扬麦1号和武麦1号等。

5.2 杂交育种

利用感病亲本杂交,由于抗病基因的突变、累加和重组而出现超亲遗传,它们对赤霉病均表现较好的抗性。苏州地区农科所 1968年从阿夫 /台湾小麦的杂种后代中育成的苏麦 3号经广泛而严格的鉴定已被确认为国内外最好的抗源。镇江地区农科所从南农复穗黄/四川友谊麦后代中选育出镇7495,都是运用杂交育种方法得到的新品种。

5.3 太谷核不育基因的利用

传统的育种途径选育高产抗赤霉病的小麦品种有一定的局限性。吴兆苏等提出了“小麦抗赤霉病基因库的建拓”的育种方案。这种基因库是利用小麦显性雄性不育基因Tal(MS2),通过多亲本聚合杂交和表型混合选择与后代测定选择相结合的轮回选择来建拓。在任何轮选周期均可将不同的新资源导入基因库使之继续得到开拓,而基因库中的各种优良基因也可陆续被提取以发展为新良种。

5.4 生物工程技术

细胞工程技术已成为农作物遗传改良的重要途径之一。自1980年起,江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所、中国科学院遗传研究所和华中农业大学的学者开展了小麦抗赤霉病生物技术育种研究,并取得了较大的进展。

6 问题及展望

中国农业科技工作者经过半个世纪的共同努力,小麦抗赤霉病育种取得了较明显的进展,育成了一批抗赤霉病品种(系),并在大面积生产上发挥了较大的作用。但纵观国内外的小麦抗赤霉病育种,所使用的抗源单一,育成品种抗性逐渐减弱,开拓新的抗源已成为当务之急。所以广泛搜集和鉴定国内外小麦品种资源、小麦近缘属及野生资源,通过诱变人工创造新的抗源,是当前研究的主要目标。

小麦抗赤性鉴定是抗病育种的基础工作。在自然条件下鉴定,常因缺乏病害流行的必要条件而得不到预期的结果,因此需要采用人工接种诱发病害进行鉴定。田间单花接种及麦穗离体室内接种不能满足世代大群体鉴定的需要。土表接菌或花期喷菌法,以病穗率和病情指数为记载标准,但病情指数是一个波动性指标,受环境影响大,对大量选种材料进行鉴定又不太实际。因此必须改进抗性鉴定技术,尽量运用分子标记技术以便快速、可靠地鉴定抗性资源。

选育抗赤霉病、高产、优质的小麦新品种可采用以下 3种育种方法:复合杂交、利用小麦显性雄性不育基因、应用生物工程技术。近几年,随着细胞遗传学、分子遗传学和分子生物学技术的不断发展,应用生物工程技术进行选育将日益成为今后小麦抗赤霉病性研究的重要途径和手段。应用生物工程的研究技术既可以快速、有效地转移和组合抗赤霉病基因,得到新的抗原,有效地培育抗病的优良品种,也将为进一步分离和克隆抗病基因、阐明致病与抗病生理生化机理及相互作用机制奠定基础。

[1]王美芳.美国小麦赤霉病研究现状[J].世界农业,2000,(6):32-33.

[2]BoshoffWHP,Swart W J,Pretorius ZA.Isozyme characterization ofFusariumgraminearumisolates associated with head blight of irrigated wheat in South Africa[J].South African Journal of Botany,1999,65(4):281-286.

[3]商鸿生,井金学.关中麦区小麦赤霉病流行分区研究 [J].植物保护学报,1999,26(1):40-44.

[4]王 芊,姜海洋.黑龙江省小麦赤霉病菌致病力的初步研究 [J].黑龙江农业科学,2000,(4):14-15.

[5]Carter JP,Rezanoor HN,Desjardinas AE,et al.Variation inFusarium graminearumisolates from Nepal associated with their host of origin[J].Plant Pathol,2000,49:452-460.

[6]Carter JP,Rezanoor HN,Holden D,et al.Variation in pathogenicity associated with the genetic diversity ofFusarium graminearum[J].Plant Pathology,2002,108:573-583.

[7]Walker SL,Leath S,Hagler WM,et al.Variation among isolates ofFusarium graminearumassociated withFusariumhead blight in North Carolina[J].Plant Dis,2001,85:404-410.

[8]宋庆杰,肖志敏,辛文利.黑龙江省小麦抗赤霉病育种研究进展 [J].黑龙江农业科学 ,2002,(5):21-23.

[9]Karina F,Ribichich MV,Silvia E,et al.Histopathological spikelet changes produced byFusarium graminearumin susceptible and resistant wheat cultivars[J].Plant Dis,2000,84(7):794-802.

[10]王雅平,刘伊强.小麦对赤霉病抗性不同品种的 SOD活性[J].植物生理学报 ,1993,19(4):353-358.

[11]陈利锋,聂 理.抗感赤霉病小麦品种超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性比较 [J].植物病理学报,1997,27(3):209-212.

[12]王广金.抗、感小麦品种对赤霉病菌毒素的反应 [J].植物病理学报,1999,29(4):320-325.

[13] 陈耀锋,李春莲.普通小麦抗赤霉细胞工程育种研究Ⅱ.抗镰刀菌毒素细胞变异 [J].农业生物技术学报,1999,7(2):147-150.

[14]黄 昌,牟建梅,刘敬阳.小麦赤霉病抗性鉴定和新抗源筛选 [J].江苏农业科学,2000,2(5):24-28.

[15]方毅敏,肖碧玉.小麦抗赤霉病性田间自然鉴定与抗赤霉病育种中的问题[J].植物保护学报,1998,26(4):294-298.

[16]孙光祖,李忠杰.小麦抗赤霉病突变体的选育及 RAPD分子验证 [J].核农学报,1999,13(4):202-205.

[17]Nakamura C,Kodo N,Shimizu T,et al.Construction of physical maps ofmitochondrial DN As inFusariumspecies causingFusariumhead blight[J].Cereal Research Communications,1998,25(3):321-324.

[18]Waldron BL,Moreno SB,Anderson JA,et al.RFLP mapping of Q TL forFusariumhead blight resistance in wheat[J].Crop Science,1999,39(3):805-811.

[19]Bai GH,Kolb FL,Shaner G,et al.Amplified fragment polymorphism markers linked to a major quantitative trait locus controlling scab resistance in wheat[J].Phytopathology,1999,89:342-348.

[20]陆悦健.抗苯并咪唑的小麦赤霉病菌β-tubulin基因序列分析与特性研究[J].植物病理学报,2000,30(1):30-34.

[21]姚金保,陆维忠.中国小麦抗赤霉病育种研究进展 [J].江苏农业学报,2000,16(4):242-248.