2011年美国骨髓移植会议临床热点荟萃

盛立霞 肖浩文 黄河

2011年2月17—21日美国骨髓移植会议(Bone Marrow Transplant Tandem Meeting)在美国夏威夷举行，来自世界各地的4000余名造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)专家和代表参与，650余份论文交流，其中口头报告100余份。大会主题涉及造血干细胞及移植免疫的基础研究、HSCT后过继细胞免疫治疗、非清髓预处理在脐血及单倍体相合HSCT中的应用、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)对移植预后的影响以及异基因HSCT后复发的治疗等。本文就部分临床热点内容作一简介。

1 HSCT领域的基础研究热点

造血干细胞自我更新的机制和定向分化条件一直是干细胞研究的热点。西班牙Himburg［1］研究小组发现来自微环境的多效蛋白(pleiotrophin，PTN)信号通路在造血干细胞的自我更新中有重要作用。在体外培养中使用肝素结合蛋白和PTN处理鼠和人的造血干细胞可以显著诱导造血干细胞的自我更新。研究组使用PTN基因敲除(PTN-/-)小鼠发现其在产生总的骨髓细胞和骨髓克隆形成细胞方面没有显著的差异，但是CD34-c-kit+sca-1+lin-(简称34-KSL)细胞的数量明显减少，同时集落形成单位减少了2倍以上，而PTN-/-小鼠长期重建造血干细胞的比例下降11倍。将同基因小鼠骨髓分别移植给PTN-/-或PTN+/+小鼠形成嵌合体，PTN-/-小鼠中骨髓34-KSL及脾集落形成单位数量较PTN+/+明显减少，进一步证实骨髓微环境中PTN的表达对造血干细胞是必须的。实时定量PCR检查发现在野生型小鼠中无论骨髓成骨细胞还是内皮细胞均表达PTN。在非接触培养体系中共同培养骨髓内皮细胞和骨髓，加入抗PTN抗体能明显阻断骨髓内皮细胞的支持。这些研究表明PTN由在骨髓龛位中的内皮细胞分泌，并且PTN信号对于维持体内骨髓造血干细胞池是必要的。

在HSCT后，无论造血干细胞或者同种异体反应性T细胞均快速增殖，增殖活跃的细胞通过氧化磷酸化作用或者糖酵解增加腺苷三磷酸以获得足够的能量。佛罗里达大学Wahl［2］研究小组在小鼠移植模型中发现造血干细胞与同种异体反应性T细胞在快速增殖过程中的能量代谢途径的差异。在同基因移植的小鼠模型中(B6移植至B6-Ly5.2)，增殖中的造血干细胞及祖细胞糖酵解活性增高3倍，而氧化磷酸化则没有改变。而与此不同的是，在B6移植至B6D2F1的移植物抗宿主病(graft-versushost disease，GVHD)模型中，同种异体反应性T细胞中的氧化磷酸化表达较未受激的T细胞表达增高2倍以上，可提供80% ～90%的腺苷三磷酸供能。T细胞更快的增殖速度及氧化磷酸化的活性增高可能与增加的氧化应激反应有关，细胞内活性氧增加，而抗氧化剂减少。骨髓细胞的增殖并没有表现出这个异常的生理学代谢过程。为此研究组使用一种新型的苯二氮卓类药物Bz-423来模拟这一异常的氧化还原过程。单剂量的Bz-423可以使得同种异体反应性T细胞细胞内活性氧增加2倍以上，凋亡增加了50%。而该药物在未激活的T细胞、B细胞及增殖的造血干细胞中没有增加细胞内活性氧或者诱导凋亡的效果。6个剂量的Bz-423在重度GVHD模型中明显降低小鼠死亡率，同时减轻了肝和肠道中GVHD相关的病理学改变，并且Bz-423的治疗并没有造成免疫重建延迟或者植入失败。但Bz-423和caspase泛抑制剂一起使用时生存优势完全丧失，由此推测Bz-423的疗效主要是减少凋亡。该研究发现了同种异体反应性T细胞特有的异常的代谢途径，这个途径以增加氧化磷酸化及消耗抗氧化剂为特征，这一有别于正常造血干细胞的特点有望成为抗GVHD药物的新靶点。

基因靶向治疗在人类遗传性出血性疾病的治疗方面具有潜在的应用前景。Du［3］研究小组报道通过基因工程获得产凝血因子Ⅷ的血小板可以用来治疗犬类血友病。他们采用犬粒细胞集落刺激因子/干细胞因子动员出犬的外周造血干细胞，进而分选CD34+细胞，通过慢病毒转导入相关基因，包括血小板特异性整合素aⅡb基因的启动子及人的凝血因子Ⅷ基因。所有的实验动物均表现出血友病A临床症状改善，凝血时间明显缩短。这些研究结果为人类遗传性出血性疾病的治疗提供了一条新的途径。

2 过继细胞免疫治疗的疗效及安全性

异基因HSCT后免疫重建延迟将导致病毒感染发生率增高。EB病毒、CMV和腺病毒是HSCT后最常感染的致病性病毒，采用这些病毒特异性的细胞毒T淋巴细胞过继治疗有望在移植早期恢复机体的病毒免疫力，提高移植疗效。然而，制备特异性产品需要花费较长时间，这限制了其应用。Leen［4］研究小组探讨通过输注HLA部分相合的异基因细胞毒T淋巴细胞治疗耐药的病毒感染的可行性、安全性和有效性。该研究小组采用美国心肺血液研究所细胞治疗援助计划产品，生产并检测了30多个多病毒特异性的多克隆T细胞系，抗病毒特异性针对CMV、EB病毒和腺病毒。至目前共筛查53例患者，49例可以鉴定出可能合适的多克隆细胞系，其中29例接受1～3个HLA位点相合的1～3种细胞系的输注(原发病包括难治性EB病毒相关的移植后淋巴细胞增生性疾病6例、持续CMV感染13例、持续腺病毒感染9例、CMV和腺病毒同时感染1例)。治疗后2例之前有皮肤急性GVHD及慢性GVHD的患者病情活动，2例出现短暂的皮疹，2例发生血栓性微血管病(患者有西罗莫司治疗史等其他危险因素)。26例患者在治疗后42 d完全缓解和部分缓解率为84.6%，其中CMV感染92.3%、EB病毒感染80%、腺病毒感染75%。令人振奋的是其中16例患者获得完全病毒免疫力，包括采用只有1个HLA位点相合的细胞系治疗的患者。这些结果表明采用库存细胞毒T淋巴细胞系对异基因HSCT受者进行抗病毒治疗是一个切实可行的治疗策略。

目前很多研究报道EB病毒和CMV特异性T细胞具有异源HLA反应性，这些病毒特异性的T细胞输注到HLA部分相合的受者体内时，可能会导致GVHD。Melenhorst［5］小组的研究却证实异基因病毒特异性T细胞虽然具有HLA异源反应性，但是并不会导致GVHD。他们选取153对异基因HSCT供、受者，包括73对HLA部分相合者，将供者来源的病毒特异性T细胞输注给受者。输注细胞毒T淋巴细胞后，无新发的GVHD，原有GVHD的复发率为6.5%，与HLA是否相合无显著关系。随后，他们采用已知不表达CMV和EB病毒抗原的活化T细胞作为抗原呈递细胞，分析4个供者来源的双病毒特异性T细胞系的HLA异源反应性。在体外研究中发现病毒特异性细胞毒T淋巴细胞与受者抗原呈递细胞具有HLA异源反应性，但是与GVHD的发生无相关性，因此患者接受经典的HLAⅠ类和(或)Ⅱ类基因不相合的供者病毒特异性细胞毒T淋巴细胞输注是安全的。

3 非清髓预处理在脐血移植及单倍体相合移植中的应用

在找不到HLA相合同胞供者的情况下，脐血和亲缘HLA单倍体相合供者也是目前广泛采用的造血干细胞来源。本次大会报告了血液骨髓移植临床试验网开展的非清髓性预处理在这两类移植中的临床试验结果［6］。“无关供者双份脐血非清髓移植治疗血液系统恶性肿瘤的Ⅱ期临床试验”前瞻性评估在预后差的白血病及淋巴瘤患者中进行双份脐血非清髓移植的疗效。入选患者年龄小于70岁，器官功能及体能状况能够耐受移植。预处理方案:氟达拉滨40 mg/m2静脉滴注-6～-2 d(以移植当天为0 d，移植前为负数，移植后为正数表示时间)，环磷酰胺50 mg/kg静脉滴注-6 d，全身照射200 cGy-1 d。免疫抑制采用钙调磷酸酶抑制剂联合吗替麦考酚酯，粒细胞集落刺激因子从+1 d开始。所有患者接受HLA 4～6个位点相合的双份脐血。16个中心共有54例入组，中位年龄58(16～69)岁，其中4例退出试验。50例可评估患者的中位随访时间364(154～381)d。6个月总体存活率72%(95%CI 56% ～83%)，疾病无进展存活率 63%(95%CI 48% ～76%)。180 d累积治疗相关死亡率20%(95%CI 8% ～31%)，复发或进展率 4%(95%CI 4% ～24%)。18例死亡，复发或进展是主要死因。56 d累积Ⅱ～Ⅳ级急性 GVHD发生率36%(95%CI 22% ～50%)，Ⅲ ～ Ⅳ级急性 GVHD发生率10%(95%CI 2% ～19%)，180 d慢性GVHD累积发生率13%(95%CI 3% ～24%)。56 d中性粒细胞恢复的累积发生率为94.0%(95%CI 87% ～100%)，中位恢复时间17(6～45)d。3例发生原发性植入失败，1例继发性植入失败。这些数据说明非清髓双份脐血移植是安全的，可为设计备选供者非清髓移植治疗血液系统恶性肿瘤的临床试验构建基础。

一项Ⅱ期临床试验评估在预后差的急性白血病及淋巴瘤患者中进行非清髓单倍体相合骨髓移植以及移植后大剂量环磷酰胺预防GVHD的疗效［7］。入组患者来自17个中心，有52例实行了移植，中位年龄51(7～70)岁。预处理方案:环磷酰胺14.5 mg/kg静脉滴注-6 d和-5 d，氟达拉滨30 mg/m2静脉滴注-6～-2 d，全身照射200 cGy-1 d，并输注富含T淋巴细胞的骨髓。预防GVHD的方案包括环磷酰胺50 mg/kg静脉滴注+13～+14 d，吗替麦考酚酯+15～+135 d，他克莫司+15～+1180 d。非格司亭从第15天开始用至中性粒细胞数恢复。结果，100%T淋巴细胞嵌合，1例出现原发性植入失败，无继发性植入失败。156 dⅡ级急性GVHD累积发生率31%(95%CI 18% ～44%)，1180 d慢性GVHD累积发生率11%(95%CI 1% ～22%)，无一例发生Ⅲ～Ⅳ级急性GVHD。1180 d复发或进展发生率和非复发死亡率分别是19%(95%CI 7%～32%)和5%(95%CI 0～13%)。10例出现复发或进展，13例死亡(疾病复发或进展8例、感染2例、植入失败1例)。存活受者的中位随访时间为294(76～650)d，6个月总体存活率和无事件存活率分别是82%(95%CI 65% ～91%)和75%(95%CI 59% ～86%)。该研究证明非清髓HLA单倍体相合骨髓移植是安全可行的。

4 HSCT后复发的治疗及预后评估

基础疾病复发成为异基因HSCT治疗急性白血病失败的主要原因。异基因HSCT后复发的急性髓细胞白血病或骨髓异常综合征患者的预后很差。Schroeder［8］等开展了一项前瞻性的多中心Ⅱ期临床试验，评估阿扎胞苷联合供者淋巴细胞输注作为异基因HSCT后复发的急性髓细胞白血病或骨髓异常综合征患者一线治疗的可行性。患者接受最多8个疗程的阿扎胞苷治疗 (100 mg·m-2·d-1，1～5 d，每28 d 1个疗程)，每两个阿扎胞苷疗程后给予剂量递增的供者淋巴细胞输注［(1～5)×106～(1～5)×108细胞/kg)］共3次。目前可评估患者25例，其中急性髓细胞白血病患者23例(92%，新发15例、从骨髓异常综合征进展而来8例)，骨髓异常综合征患者1例(4%)，骨髓异常综合征/骨髓增殖综合征1例(4%)。所有患者接受中位数为3(1～8)个周期的阿扎胞苷治疗，18例(72%)接受1～4次供者淋巴细胞输注(中位CD3+细胞剂量5×106/kg，范围1×106～207×106)。总体反应率为64%，其中5例(20%)获得完全缓解，3例(12%)获得部分缓解，8例(32%)病情稳定，中位反应维持时间266 d。6例(24%)出现急性GVHD(皮肤2例、肝6例、肠道2例)，中位发生时间为第1次供者淋巴细胞输注后的65(19～179)d，3例(12%)出现局限性慢性GVHD。Ⅲ～Ⅳ度血液学毒性发生率为64%，常见的不良事件是胃肠道副作用以及感染。中位随访时间100(25～485)d，15例(60%)存活，受者中位存活时间为184(87～281)d。所有获得完全缓解的患者继续保持缓解状态的中位时间229 d。采用阿扎胞苷联合供者淋巴细胞输注作为异基因HSCT后复发的急性髓细胞白血病或骨髓异常综合征患者的拯救性治疗具有显著的抗白血病作用。

美国血液学协会发布的基于循证医学的最新指南对移植后复发受者进行二次移植的推荐类别为1B，然而哪些患者会从二次移植中获益尚不确定。Rezvani［9］等报告采用欧洲骨髓移植组(European Bone Marrow Transplant Group，EBMT)建立的用于慢性粒细胞白血病的危险评分系统预测二次异基因HSCT患者预后的价值。他们分析了1985年10月—2010年2月采用异基因供者干细胞进行二次移植的124例受者的预后因素。第1次移植干细胞来源于自体的患者64例、异基因的患者60例。患者年龄、疾病分期、从发病到移植的时间、供者类型、供受者性别组合被纳入评分系统(0～7分)，根据评分分为高、中、低危3组。多变量分析发现高死亡率与两个重要因素相关:危险度评分(高危组与低危组RR=2.89，P≤0.001)和两次移植的时间间隔(大于 20个月组与小于20个月组 RR=1.55，P ＜0.05)。EBMT评分采纳的5个移植前患者及供者特征能够对二次移植效果进行很好的风险预测，结合两次移植时间间隔和EBMT评分能够更加精确地预测预后，有助于选择从二次移植中最可能获益的患者。

5 活化型KIR对HSCT预后的影响

既往的研究多集中在抑制性KIR对移植预后的影响，近年来，活化型KIR对异基因HSCT预后的影响也逐渐引起关注。Venstrom［10］研究小组报告了端粒端KIR2DS1和KIR3DS1基因，以及着丝粒端KIR2DS2基因对进行非亲缘异基因HSCT后的预后影响。回顾性分析1989—2008年间进行HLA(9～10)/10位点相合的非亲缘异基因HSCT的急性髓细胞白血病患者1228例。应用Cox回归分析法分析供者KIR基因型与移植效果的相关性。422名供者为 KIR2DS1阳性，429名供者为KIR3DS1阳性(其中355名供者KIR2DS1和KIR3DS1同时阳性)，630名供者为KIR2DS2阳性。供者KIR2DS1基因与较低的疾病复发有关［HR=0.76(0.61～0.96)，P=0.02］，根据共表达 KIR2DS2和 KIR3DS1情况分别进行校正后这一相关性依然存在。供者的KIR3DS1基因型与降低非复发死亡率［HR=0.68(0.50～0.92)，P=0.01］和总体死亡率［HR=0.79(0.63 ～0.98)，P=0.03］相关。供者 KIR2DS2 基因与移植后存活率、复发率和非复发死亡率无显著相关性。活化型KIR基因的个体差异性可能对急性髓细胞白血病患者进行非亲缘异基因HSCT的效果有不同的影响，KIR2DS1防止疾病复发，而KIR3DS1可以减少非复发死亡率。

中国苏州的Wei［11］等也报道了活化型KIR基因对HLA相合亲缘HSCT预后的影响。他们采用序列特异性引物PCR技术检测进行HLA全相合同胞供者HSCT的40对供受者的KIR基因型，回顾性分析这些患者的预后。在40对供受者中KIR2DS4、KIR2DS1、KIR3DS1、KIR2DS5、KIR2DS2 和 KIR2DS3基因的出现频率分别是95%、40%、36.25%、31.25%、21.25%和20%。KIR2DS4*001/002和 KIR2DS4*003-007纯合子概率分别是55.9%和8.8%，而KIR2DS4*001/002和KIR2DS4*003-007杂合子概率是35.3%。供者无KIR2DS2基因移植后疾病复发率为19.2%，而供者具有KIR2DS2基因疾病复发率为0。KIR单体型为A/A的供者，如果供者具有KIR2DS4*003-007杂合子，移植后的1年无病存活率是70%，供者为KIR2DS4*001/002纯合子基因型，则移植后1年无病存活率是87.5%。如果供者具有3个及以上活化型KIR基因，1年无病存活率是72.2%;如果供者只有1～2个活化型KIR基因，1年无病存活率为81.8%。在HLA相合同胞供者的HSCT中，活化型KIR基因表达的数目及亚型可能与低疾病复发以及改善HLA相合同胞移植的预后相关。

6 HSCT供受者病毒感染的临床特征及预后

CMV和HBV在中国人群中是常见的感染病原体，在移植前供者及受者体内可能是隐性感染或者携带状态，HSCT后宿主的免疫抑制状态增加了病毒再激活的机会。浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心“HSCT后早期CMV感染风险与T淋巴细胞协同刺激分子的基因多态性有关”的论文是大会口头报告论文之一［12］。该研究检测了116对无关供者HSCT及87对HLA相合HSCT中供受者的5种单核苷酸多态性:CD28-594(A/G)、ICOS-693(G/A)、CTLA-4-1722(A/G)、149(A/G)和 CT60(A/G)，并分析这些单核苷酸多态性与 HSCT后100 d内CMV感染的关系。结果发现，除1名来自台湾的供者外，所有患者和供者均为CMV血清学IgG阳性。117例患者(57.6%)在HSCT后早期出现CMV感染，发生感染的中位时间为26(2～64)d。其中23%发生在粒细胞缺乏期，77%在粒细胞恢复以后。92.3%患者为无症状的CMV抗原阳性，仅有9例患者发生CMV相关疾病(CMV肺炎7例和CMV肠炎2例)。在无关供者和亲缘供者的HSCT中，当供者基因型为CTLA-4 CT60 AA时，受者发生移植后早期CMV感染的概率比供者基因型为AG/GG的受者高。通过多变量分析确定了4个早期CMV感染的危险因素:患者HSCT前的CMV再激活、无关供者移植、患者发生急性GVHD以及供者为CTLA-4 CT60 AA基因型。提示抗病毒预防性治疗及抢先治疗有效，首次发现T淋巴细胞协同刺激分子的基因多态性与早期CMV感染具有相关性。

中国是HBV感染的高发区，阐明HBV感染对异基因HSCT的影响及进一步明确有效的防治措施十分必要。浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心回顾性分析了供者为HBV血清学阴性、受者为HBV感染的无关供者 HSCT后效果［13］。1998—2009年5月间共有222例患者进行了无关供者HSCT。移植前HBsAg阳性组17例，均接受了拉米夫定或恩替卡韦治疗;移植后该组中1例患者发生了病毒再激活，8例患者HBsAg转为阴性并出现了HBsAb。154例移植前HBsAg和HBcAb均阴性患者移植后均未出现HBsAg阳性。51例移植前HB-sAg阴性而HBcAb阳性患者中2例发生了病毒性肝炎，1例经拉米夫定治疗后病情改善，还有1例死于HBV相关的肝功能衰竭。总体存活率和急性GVHD、慢性GVHD发生率在3组中差异均无统计学意义。提示受者HBV感染经积极的抗病毒预防和治疗并不影响异基因HSCT预后，受者HBV感染不是移植的禁忌证。

1 Himburg HA，Daher P，Russell L，et al.Pleiotrophin signaling is necessary for hematopoietic stem cell self renewal and is regulated by the bone marrow microenvironment［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S149.

2 Wahl DR，Gatza E，Opipari AW，et al.Manipulation of the bioenergetics of alloreactive T cells leads to their selective apoptosis and arrests graft versus host disease［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S149.

3 Du LM，Franck HWG，Merricks EP，et al.Gene therapy targeting synthesis of coagulation factorⅧin platelets reduces bleeding in canine hemophilia A［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S149-S150.

4 Leen AM，Bollard CM，Mendizabal A，et al.Most closely HLA-matched allogeneic virus specific cytotoxic T-lymphocytes(CTL)to treat persistent reactivation or infection with adenovirus，CMV and EBV after hemopoietic stem cell transplantation(HSCT)［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S151-S152.

5 Melenhorst JJ，Leen AM，Bollard CM，et al.Allogeneic virus-specific T cells with HLA alloreactivity do not produce graft-versus-host disease in human subjects［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S158.

6 Brunstein CG，Carter S，Fuchs EJ，et al.PhaseⅡtrial of non-myeloablative conditioning(NST)double umbilical cord blood transplantation(DUCBT)from unrelated donors in patients with hematologic malignancies:results of blood and marrow transplant clinical trials network(BMT CTN)protocol 0604［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S151.

7 Fuchs EJ，Wu J，Carter S，et al.PhaseⅡtrial of non-myeloablative conditioning and partially HLA-mismatched(HLA-haploidentical)bone marrow transplantation(BMT)for patients with hematologic malignancies:results of blood and marrow transplant clinical trials network(BMT CTN)protocol 0603［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S151.

8 Schroeder T，Czibere AG，Kröger N，et al.Combining azacitidine(vidaza®，aza)and donor lymphocyte infusions(DLI)as first salvage treatment in patients(PTS)with acute myeloid leukemia(AML)or myelodysplastic syndromes(MDS)relapsing after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(allo-SCT):interim-analysis from the azarela-trial(NCT-00795548)［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S159.

9 Rezvani K，Marin D，Goldman JM，et al.Risk score predicts outcome of second allogeneic hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S155.

10 Venstrom JM，Pittari G，Chewning J，et al.Donor KIR2DS1 and KIR3DS1 are associated with improved outcomes following unrelated allogeneic stem cell transplantation for acute myeloid leukemia［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S156.

11 Wei X，Feng Y，Sun A，et al.Impact of the distribution and the effect of kirs and activating KIR on outcome of HLA-identical sibling hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S295-S296.

12 Xiao H，Luo Y，Shi J，et al.T-cell costimulatory molecule genotypes are associated with the risk of early cytomegalovirus infection after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S156.

13 Luo Y，Hu Y，Tan Y，et al.Virologic and clinical outcomes of hepatitis B virus infection in recipients undergoing unrelated-donor hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2011，17(Suppl 2):S303.