肺癌分子靶向治疗和疗效评价体系

许 诺 白春学

肺癌是严重危害人类健康的疾病,在我国已超过癌症死因的 20%,发病率及病死率均迅速增长,诊断时三分之二的患者已经丧失手术机会,需要非手术治疗方法。但是传统的化疗作为治疗肿瘤的有效措施,已经达到平台期。因此,分子靶向治疗的出现为肺癌的非手术治疗提供了新的方法。肿瘤分子靶向治疗(molecular targeted therapy)是近年来发展迅速的利用肿瘤细胞与正常细胞间分子生物学上的差异,阻断信号传导通路、封闭受体、抑制血管生成,作用于肿瘤细胞特定的靶点,特异性地抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移,促进其凋亡的治疗方法。由于靶点特异,分子靶向治疗比传统化疗具有更高的选择性,更小的不良反应,其抑制细胞生长的作用机制使之更适于连续口服的给药方式,因而尤其适用于特定肺癌人群。

一、传统肺癌靶向治疗

目前应用于临床的肺癌分子靶向治疗主要包括以表皮生长因子受体(epidermal grouth factor receptor,EGFR)为靶点的药物,以及抗肿瘤血管新生的靶向治疗药物。

1．以 EGFR为靶点的抑制剂

EGFR在肿瘤细胞增殖、浸润、转移和血管形成中起着重要作用,针对 EGFR的靶向治疗药物主要有两类:一类是作用于 EGFR受体胞内区酪氨酸激酶区的小分子抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI),另一类是作用于受体胞外区的单克隆抗体 (monoclonal antibody,MAb),包括西妥昔单抗(cetux imab)、帕尼单抗(vectibix)等。

酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-trosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)可以特异性阻断 EGFR下游通路并抑制肿瘤的发生、发展[1]。临床上广泛应用的EGFR-TKI主要为吉非替尼和厄罗替尼。多个临床实验证明EGFR突变患者应用EGFR-TKI多可获得较高缓解率和生存受益。另外,除了EGFR突变,EGFR扩增、K-ras突变、M et扩增和 EML4-ALK突变等肿瘤细胞分子特征都被用于预测肿瘤药物治疗有效性。四项大型 III期临床试验 INTACT1[2]、INTACT2[3]、TRIBUTE[4]、TALENT[5]将 EGFR-TKI分别与化疗药物联用,比较非小细胞肺癌(nons m all all lung cancer,NSCLC)治疗中联用疗效是否优于单独应用化疗药物,试验结果显示与单独化疗相比,EGFR-TKI与化疗联用并未显示出临床优势。但是在多中心随机 III期临床试验中[6],通过对 731位曾经接受过治疗的NSCLC患者的研究,结果显示厄罗替尼可以改善NSCLC患者的生存率。因此,厄罗替尼被批准用于晚期NSCLC患者二线或三线的治疗。然而,临床试验 ISEL[7]结果却提示吉非替尼作为二、三线治疗方案,与安慰剂组相比,其疗效不具有统计学差异。分析以上两组试验发现,造成结果差异的原因可能是由于临床试验中研究人群、剂量以及药物的不同所致。随后在 IPASS试验中,选择入组了 1 217名亚裔、腺癌的NSCLC患者,并予以上患者吉非替尼或培美曲塞 /卡铂作为一线治疗的方案。结果显示,在具有 EGFR突变的患者中,吉非替尼可以显著改善无进展生存期(progression free surviva,l PFS)。因此,亚洲学者的IPASS结果支持EGFR-TKI(吉非替尼和厄洛替尼)一线治疗 EGFR突变患者。而最新的美国国立综合癌症网络(National Comprehensive CancerNetwork,NCCN)肺癌治疗指南也推荐将厄罗替尼作为存在 EGFR突变的NSCLC患者一线治疗。对于厄洛替尼一线治疗后进展的患者,可选含铂双药方案二线治疗(2B类)。《指南》将化疗联合厄洛替尼改为 3类推荐。但对于突变状态不明者,一线治疗仍应首选化疗。

2．抗血管新生药物

肿瘤生长依赖于新生血管输送营养支持。这一过程受到许多信号的共同调节,而其中以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VECF)的研究最为深入[8]。因此,另一类靶向治疗药物主要包括抗VEGF及血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)的单抗和 VEGFR EGFRTKI,这类抗血管新生药物可以抑制肿瘤血管生成,从而抑制肿瘤的发生、发展和转移。贝伐单抗(avastin)是一种抗VEGF的单克隆抗体药物,它通过抑制能够刺激血管新生的VEGF,使肿瘤组织失去血供,从而限制肿瘤生长,最终达到抗癌功效。美国食品与药物管理局(Food and Drug Adm inistration,FDA)批准贝伐单抗联合卡铂和紫杉醇用于晚期非鳞状上皮细胞、NSCLC患者的初始治疗。这个方案主要基于 III期临床试验ECOG的结果。ECOG将 NSCLC患者随机分为化疗治疗组和化疗联合贝伐单抗(15mg/kg)治疗两组[9]。研究结果显示,加入贝伐单抗的试验组患者整体生存期(10．3月 vs 12．3月)和无进展时间 (4．8月 vs 6．2月)明显改善。但在另一个大型临床试验中,应用贝伐单抗联合治疗并未显示出其优势,研究结果仅具有统计学意义,中位无进展生存期仅有较小改善[10]。在这两个临床试验中,贝伐单抗与化疗联用同时都出现了较多的不良反应,主要有发热、白细胞减少、高血压、咯血和蛋白尿等。鳞癌患者在使用贝伐单抗后更容易出现咯血现象,故不推荐该亚型患者使用贝伐单抗[11]。同时,在老年肺癌人群(＞70岁)中,贝伐单抗的使用容易引起不良反应,且有趋势显示此不良反应可以造成相关死亡。故尽管对于NSCLC患者,贝伐单抗具有一定的治疗效用,但只有根据患者自身情况进行适当筛选才可以最大地发挥药物疗效,降低其不良反应。目前,我国自行生产的重组人血管内皮抑制素注射液为恩度(endostar),主要与联合长春瑞滨和顺铂(NP方案)联用,用于初治或复治的 III/Ⅳ期NSCLC的治疗。但目前,关于恩度是否可以作为一线治疗方案或单独使用治疗肺癌仍是临床有待解决的问题。

SATURN[12](以厄洛替尼维持)和 ATLAS(以厄洛替尼+贝伐单抗维持)两项研究也显著改善了 PFS。肺癌临床治疗正逐渐接受维持治疗作为一种有效、可行的治疗模式,但上述研究仍存在的问题是何时应用靶向药物作为维持治疗更为合适;靶向治疗用作进展后二线治疗方案和维持治疗,哪一个对患者更为有利。

二、新型肺癌分子靶向治疗药物

由于目前应用于临床的分子靶向治疗药物存在耐药现象严重、特殊群体有限和促进肿瘤转移等情况,因此新型靶向药物的开发显得尤为重要,新型靶向药物的应用近年来也取得了显著的进展。

1．促进肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是维持生理状态的必要环节。而肺癌细胞中常出现凋亡信号通路的紊乱,从而导致肿瘤细胞的无限扩增,故促进肿瘤细胞凋亡的药物研发已成为当今肺癌治疗的一个重要方向。

(1)Src和 SFKs抑制剂 非受体蛋白酪氨酸激酶 SFKs(Src fam ily kinases,Src酪氨酸激酶家族)在包括肺癌在内的多种肿瘤中表达明显升高。SFKs可以激活 PDGFR、VEGFR、EGFR、HER2/3以及 STAT s,并与它们共同作用抑制肿瘤细胞的凋亡,因此有效的抑制 SFKs,可以促进肿瘤细胞的凋亡,起到治疗肿瘤的作用。SFKs抑制剂主要包括 dasatinib(BMS-354825)、AZD-0530、XL-999。它们与 SFKs的酪氨酸激酶位点结合和 /或阻断 SH2和 SH3位点从而抑制 SFKs活化,进而抑制肿瘤的发生发展。

Dasatinib是美国 FDA唯一批准的 SFK抑制剂,可以有效抑制包括 Src在内的 SFKs的自磷酸化。Demetri等将 Dasatinib用于治疗晚期肺部肿瘤的临床试验结果显示一定疗效,约 16%的肿瘤患者治疗后疾病稳定,同时单药不良反应可以耐受。因此,可以作为化疗无效后的二线药物进行 III期临床试验[13]。其它的小分子抑制剂AZD-0530,XL-999作为治疗包括NSCLC在内的转移性肿瘤的药物,也在进行 I期或 II期临床试验。

(2)组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂 组蛋白乙酰化水平可以调控染色质的活性,改变基因表达的表观遗传学特征,同时还可以影响非组蛋白转录因子等的表达。肿瘤细胞中,HDAC的功能和表达往往出现异常变化。而HDAC抑制剂可以促使细胞周期停滞、抑制细胞分化、诱导细胞凋亡而起到抗肿瘤的作用[14]。

HDAC抑制剂包括非选择抑制剂Vorinostat、Panobinostat和选择性抑制剂Rom idepsin、MS-275。其中,Vorinostat作为单药用于治疗晚期肺部肿瘤的 I期临床试验显示,口服生物利用度高,在外周血单个核细胞中可以有效抑制组蛋白的乙酰化,临床长期应用不良反应小,且具有较广泛的抗肿瘤作用。而在治疗复发性NSCLC的 II期临床试验中,尽管客观缓解率并不理想,但是 14位患者中有 8位中位疾病稳定期达 3．7个月,中位疾病进展时间为 2．3个月。因此,可以考虑 Vorinostat联合其他药物治疗复发性NSCLC[15]。Vor-i nostat联用培美曲塞和卡铂治疗晚期肺部肿瘤的 I期临床试验中,Vorinostat(400 mg口服一天一次 14 d或300mg口服一天两次 7 d)与卡铂(药时曲线下面积=6mg/mL m in)或与培美曲塞(200 mg/m2)联用,患者均可以耐受。25名患者中,11名部分缓解(10例NSCLC,1例头颈癌),7名患者病情稳定。Vorinostat在未接受其他治疗的NSCLC患者中具有良好的抗肿瘤作用[16]。

(3)蛋白酶体抑制剂 泛素-蛋白酶体蛋白降解途径调节机体细胞内蛋白水平与功能,其调节异常与肿瘤的发生发展有关。蛋白酶抑制剂可以稳定 IκB,降低核内NF-κB的活性,增加化疗药物敏感性,同时介导细胞周期停滞,稳定前凋亡蛋白(p53,Bax)并减少抗凋亡因子(Bc-l 2)的表达,以促进细胞凋亡[17]。

Bortezom ib是一种可逆性的蛋白酶抑制小分子,通过抑制 Bc-l 2家族蛋白的作用进而调控细胞凋亡。单药用于治疗NSCLC的 I期和 II期临床试验显示临床疗效中等,但在与 EGFR抑制剂 gefitinib,vandetanib和cetux imab联用的离体实验中,二者药物具有协同的抗肿瘤作用[18],同时 Bortezom ib对 9种表达 EGFR的肺部肿瘤细胞系的细胞抑制率均呈剂量依赖性。

2．干扰细胞信号传导通路

丝氨酸 /苏氨酸激酶m-TOR(mamm alian target of rapa mycin),可以影响转录的启动,促进细胞周期由G1期向 S期进展,调控新生血管的形成以及癌细胞的转移。肿瘤中m-TOR信号通路的上游调控环节时常出现异常,表现为 AKT的磷酸化水平增加、TSC蛋白过度失活等。雷帕霉素作为m-TOR特异性抑制剂,可以抑制m-TOR的作用,还可以快速抑制包括ASK1、JNK在内的应激反应,促进 c- JUN的磷酸化和凋亡。

Everol imus(RAD001)是雷帕霉素的一种新型衍生物,在实体肿瘤中具有抗肿瘤作用[19]。单药治疗NSCLC的 II期临床试验中,Everol imus分别用于曾使用过少量化疗药物的患者和曾接受少量化疗药物和EGFR-TKI共同治疗的患者,有效率分别为 4．8%和 2．3%,显示出 Everol imus较好的临床疗效[20]。联合吉非替尼治疗晚期NSCLC的 I期临床试验结果显示:5mg Everol imus联合 250mg吉非替尼,未出现严重不良反应,并且两名患者胸片上出现肿瘤缩小趋势。目前,Everol imus正在进行 II期临床试验。

3．阻断细胞周期

细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)是细胞周期调控网络的核心,细胞在其调控下进入增殖周期并完成增殖与分裂。

Flavopiridol是一种小分子 CDK抑制剂。主要通过抑制CDK1～9的活性,下调抑制周期素 D1及 VEGF的转录及表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤血管生成。该药 II期临床试验中,单药治疗未使用化疗的I V期NSCLC患者,尽管疾病稳定期较对照组有所延长,但对于 IV期NSCLC无明显细胞毒作用[21]。而在与培美曲塞和卡铂联用治疗NSCLC患者的 I期临床试验中,Flavopiridol 24 h内用量≤70mg/m2,培美曲塞 3 h滴注 175 mg/m2、卡铂 1 h滴注 AUC5,临床疗效并不十分显著[22]。

4．EML4-ALK融合基因抑制剂

EML4-ALK融合基因是由Nature于 2009年提出的与NSCLC发生相关的基因。当人类 2号染色体短臂发生突变,会编码形成 1059号氨基酸融合蛋白。该蛋白N端与人棘皮动物微管相关蛋白 4(E ML4)相似,而C端与人 ALK蛋白胞内段相似,故称之为 EML4-ALK融合蛋白。美国的一项研究发现,将载有该融合蛋白的 3T3细胞注入裸鼠体内,将会导致肿瘤形成。而体外用 EML4-ALK转染BA/F3细胞,之后再给予 ALK特异性抑制剂,细胞增殖则明显受到抑制。同时,多个国家研究试验发现,约有 5% 左右的NSCLC患者具有EML4-AKT融合基因。目前,韩国的一项 I期研究,探讨了八项 EML4-AKT融合基因的在研药物 crizotinib(PF-02341066,ALK口服抑制剂)对ALK阳性患者的疗效。该研究纳入了76例ALK阳性晚期肺腺癌患者,结果显示,客观缓解率为 57%,8周疾病控制率为 87%。患者耐受良好,以轻中度胃肠道反应和轻度视力干扰为主。EML4-AKT融合基因的表达没有地域影响,因此 EML4-AKT作为NSCLC治疗靶点前景将优于 EGFR。

三、肺癌靶向治疗疗效评价体系

2000年针对实体肿瘤疗效评价制定的RECIST(1．0)标准在历经 9年实践之后完成了首次修订,2009年1月欧洲癌症杂志(European Journal of Cancer)刊登了 RECIST修订版 (RECIST1．1)[23],同年 6月 ASCO年会对该内容的公布和解读更引发了肿瘤界的关注。进入 21世纪后倡导癌症治疗个体化、提倡综合性诊治的理念已获共识,正确理解 RECIST标准,客观评价新辅助治疗疗效应引起肿瘤专科医生足够的重视,分别采用 RECIST测量肿瘤最大直径及其最大垂直径,分别以最大径之和(LDs)及最大垂直径乘积之和(LPDs)计算疗效。按照病灶缩小百分比,疗效可分为CR、PR、SD和PD。有效率为CR+PR,总的疾病控制率为CR+PR+SD。

目前关于靶向药物治疗的疗效评定标准还有很多新的观点,有别于传统的 RISECT标准,目前还强调PRO的问题,即患者主管疗效评价体系。

目前处于 III到 I V期的肺癌患者,有 90%以上主诉有两种或两种以上的疾病相关症状,主要包括肺部相关症状如咳嗽、气短以及一般症状如乏力、疼痛和食欲减退等,此外患者还有严重的抑郁症状。因此除了生存期的改变外,以健康相关生命质量(health related quality of life,HRQOL)来评价的患者治疗效果和症状改善也很重要。

1．症状评估

其评估方法包括:可以推断出因症状改善而使患者受益的指标,如肿瘤的反应加上肿瘤相关症状或体征的改善。评估目标症状的优点在于其与以往多种评价方法相比更简单,而且方法学上的改进可能真正地反映患者的受益情况。然而仍存在一些问题:①什么是真正的患者受益的定义目前还未达成一致;②症状改变与临床的相关性并非总是明确的;③如果没有有效的评价方法,那么终点的准确性将成为一大问题。以患者症状改善来评价的方法需要患者在入选时就有相关症状,这就在一定条件下限制了患者的入选。

2．HRQOL

因为HRQOL是从多方面来评价疾病与治疗的效果,因而这些指标的观察时间有所不同,例如生活质量的评分比单个或少数几个症状来判定的观察期要长,在缺失数据时应该想到这些长期观察指标。另外,有时在区分肿瘤相关症状、治疗的不良反应以及与肿瘤无关的各种问题或症状时很困难,这些因素之间的影响也应从多角度进行分析。目前发表的而且可接受的,用心理测量学方法做成的量表中,与肺癌相关的有三个,用来评价患者生活质量改善情况,如 EORTC-LC13、FACT-L、LCSS(需要略略展开)。

同时,随着传统靶向药物临床应用中局限性的出现,新型靶向治疗药物的研究与应用近年来也取得了显著的进展,主要包括促进肿瘤细胞凋亡、干扰细胞信号传导通路、阻断细胞周期及抗血管新生等治疗策略。

四、存在问题

尽管肺癌靶向治疗已经应用于临床,但还存在一些值得思考的问题:①如何减少肺癌靶向治疗的不良反应?②如何提高治疗药物的靶向性?使得药物只作用于肿瘤细胞,减少药物对其他组织器官的影响;③需要寻找有效的分子标志物,用以预测和评价靶向药物的疗效;④如何优化靶向药物与传统的治疗方式,使得新型和传统的肺癌治疗手段得以叠加或协同,从而得到最大化的发挥;⑤区别和鉴定“靶向药物”应用后的影像学疗效和“靶向疗效”;⑥制定出靶向药物治疗的个体化方案,根据患者的不同情况,选择不同的靶向药物、合适的生物学剂量、最佳的用药时机、以及靶向药物之间的组合及应用顺序;⑦优化“靶向药物”的最终评价指标。

五、小结

肺癌的靶向治疗在NSCLC治疗中逐渐发挥重要作用,同时也为我们开启了肺癌个体化治疗的新时代。但是靶向治疗仍然存在许多有待解决的问题,需要临床医生与肺癌基础工作者共同努力,团结合作,一同攻关。相信随着肺癌靶向治疗基础研究、临床试验技术和其他相关技术的不断发展,肺癌靶向治疗药物的开发和临床应用会更加成熟。

1 W akeling AE,Guy SP,W oodburn J R,et al．ZD1839(Iressa):an orally active inhibitor of epider mal growth factor signaling w ith potential for cancer therapy[J]．CancerR es,2002,62(20):5749-5754．

2 G iaccone G,HerbstRS,M anegold C,et al．Gefitinib in combinationw ith gemcitabine and cisplatin in advanced non-s mal-l cell lung cancer:a phase III tria-l I NTACT 1[J]． J Clin Onco,l 2004,22(5):777-784．

3 HerbstRS,G iaccone G,Schiller J H,et al．G efitinib in combinationw ith paclitaxel and carboplatin in advanced non-smal-l cell lung cancer:a phase III tria-l I NTACT 2[J]． J Clin Onco,l 2004,22(5):785-794．

4 HerbstRS,PragerD,Her mann R,et al．TR I BUTE:a phase III trial of erlotinib hydrochloride(OSI-774)combinedw ith carboplatin and paclitaxel chemotherapy in advanced non-s mal-l cell lung cancer[J]． J Clin Onco,l 2005,23(25):5892-5899．

5 GatzemeierU,Pluzanska A,Szczesna A,et al．Phase III study of erlotinib in combination w ith cisplatin and gemcitabine in advanced non-smal-l cell lung cancer:the tarceva lung cancer investigation trial[J]． JC lin Onco,l 2007,25(12):1545-1552．

6 Shepherd FA,Rodrigues PJ,C iuleanu T,et al．Erlotinib in previously treated non-s mal-l cell lung cancer[J]．N Eng l JM ed,2005,353(2):123-132．

7 ThatcherN,Chang A,Parikh P,et al．G efitinib plus best supportive care in prev iously treated patientsw ith refractory advanced non-s mal-l cell lung cancer:results from a random ised,placebo-contro lled,multicentre study(Iressa Survival Evaluation in Lung Cancer)[J]．Lancet,2005,366(9496):1527-1537．

8 Ferrara N．M olecular and biological properties of vascular endothelial growth factor[J]．JM olM ed,1999,77(7):527-543．

9 SandlerA,G ray R,Perry MC,et al．Paclitaxe-l carboplatin alone orw ith bevacizumab fornon-s mal-l cell lung cancer[J]．N Eng l JM ed,2006,355(24):2542-2550．

10 P irker R,Pereira JR,Szczesna A,et al．Cetux imab plus chemotherapy in patientsw ith advanced non-s mal-l cell lung cancer(FLEX):an open-label randomised phase III trial[J]．Lancet,2009,373(9674):1525-1531．

11 Johnson DH,FehrenbacherL,NovotnyW F,et al．Random ized phase II trial comparing bevacizumab plus carboplatin and paclitaxelw ith carboplatin and paclitaxel alone in previously untreated locally advanced ormetastatic non-s mal-l cell lung cancer[J]．JC lin Onco,l 2004,22(11):2184-2191．

12 Cappuzzo F,C iuleanu T,Ste lmakh L,et al．Erlotinib asmaintenance trea tment in advanced non-s mal-l cell lung cancer:a multicentre,random ised,placebo-contro lled phase 3 study[J]．Lancet Onco,l 2010,11(6):521-529．

13 DemetriGeorge D．Phase I dose-escalation and phar macokinetic study of dasatinib in patients w ith advanced solid tumors[J]．Clinical cancer research,2009,15(19):6232-6240．

14 Lindemann RK,Newbold A,Whitecross KF,et al．Analysis of the apoptotic and therapeutic activities of histone deacetylase inhibitors by using a mouse model ofB cell lymphoma[C]．Proceedings of the national academy of sciences of theUnited StatesofAmerica,2007,104(19):8071-8076．

15 T raynorAnneM．V orinostat(NSC#701852)in patientsw ith relapsed non-s mall cell lung cancer-AW isconsin oncology ne twork phase II study[J]．JThorac Onco,l 2009,4(4):522-526．

16 Ramalingam Suresh S,Parise RobertA,Ramananthan RameshK．Phase Iand phar macokinetic study ofVorinostat,a histone deacetylase inhibitor,in combination with carboplatin and paclitaxel for advanced solid malignancies[J]．C lin CancerRes,2007,13(12):3605-3610．

17 RajkumarSV,Richardson PG,H idesh ima T,et al．Proteasome inhibition as a novel therapeutic target in human cancer[J]． J Clin Onco,l 2005,(23):630-639．

18 Cascone T,M orelliMP,Morg illo F,et al．Synerg istic ant-i proliferative and pro-apoptotic activity of combined therapy with bortezomib,a proteasome inhibitor,with ant-i epider mal growth factor receptor(EGFR)drugs in hu man cancer cells[J]． J Cell phys,i 2008,216(3):698-707．

19 Bjo rmnstiMA,Houqhton R J．The TOR pathway:a target for cancer therapy[J]．N atRev Cancer,2004,4(5):335-338．

20 Papad imitrakopoulou V,Soria JC,Douillard JY．A phase II study of RAD001(everol imus)monotherapy in patients w ith advanced non-s mall cell lung cancer(NSCLC)failing priorplatinum-based chemotherapy or priorC and EGFR inhibitors[J]． J Clin Onco,l 2007,25(165):7589．

21 Shapiro Geoffrey I,Supko Jeffrey G,Angus P,et al．A phase II trial of the cyclin-dependent kinase inhibitor flavopiridol in patientsw ith previously untreated stage I V non-s mall cell lung cancer[J]．C lin CancerRes,2001,7:1590-1599．

22 George Saby,K as imis Basil S,JanetC,et al．Phase I study of flavopiridol in combination w ith paclitaxel and carboplatin in patientsw ith non small cell lung cancer[J]．Clin Lung Cancer,2008,9(3):160-165．

23 EisenhauerEA,Therasseb P,Bogaertsc J,et al．N ew respongse evaluation criteria in solid tumours:rev ised RECIST guideline(version 1．1)[J]．Eur J Cancer,2009 45(2):228-247．