硫酸软骨素在促进成骨中的研究与应用

任光辉 徐 欣

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一种结构较复杂，硫酸化的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)是蛋白多糖(proteoglycan，PG)的重要组成成分，是由己糖羧酸和己糖氨基交替组成的带有负电荷的直链碳水化合物，其分子结构主要由D-葡糖醛酸与2-乙酰氨基-2-脱氧-硫酸-D-半乳糖组成，相对分子质量(M r)为(10-50)×103。根据硫酸基在N-乙酰基-D-氨基半乳糖的不同位置，可分为硫酸软骨素A(CS-A)、硫酸软骨素C(CS-C)、硫酸软骨素D(CS-D)等不同异构体[1]。硫酸软骨素的功能主要通过所组成的蛋白聚糖来体现，大致分为结构功能和调节功能，其分子中含有多个硫酸基和羧基，故呈酸性，可与钠、钾、钙离子等结合成盐；可促进细胞粘附，提高骨组织的强度和韧性；可键合和调节细胞因子和生长因子，抑制蛋白酶分解，并且可影响细胞的粘附、迁移、增殖和分化，所以具有生物活性。CS用于体内移植或注射，无炎症或变态反应，在动物体内可被降解为氨基葡糖参与代谢，长期服用毒副作用较低。商品CS是以健康动物(猪、牛、马、羊和鲨鱼等)软骨、气管或骨键、韧带等为原料提取的一种重要的糖胺聚糖类药物。在欧美和日本等国，CS主要作为保健食品和药品，用于防治冠心病，心绞痛，心肌梗死，骨关节炎，角膜炎，耳聋耳鸣，神经痛等疾病。

1.CS在促进骨组织生成中的作用

骨的生成是一系列的生物化学发展进程，可分为骨细胞增殖、细胞外基质的聚集和骨组织矿化三个时期，通过细胞基质的相互作用，细胞外基质分子在组织生长和细胞分化过程中起着重要作用，而硫酸软骨素是细胞外基质分子的重要组成部分。

1.1 与TGF(转移生长因子)的关系 在细胞外基质中CS能与TGF(转移生长因子)发生粘附，关于CS对TGF的调节作用还存在争议，Yamakuchi等[2]认为TGF能刺激细胞分泌CS，但与TGF的结合竞争性地抑制TGF与受体的结合，因而抑制TGF的活性，CS在调节TGF的活性方面起负反馈的作用。但Takeuchi等[3]的研究却证实CS增加TGF与受体的结合，这意味着CS增加TGF的活性。并且TGF能增加成骨细胞合成细胞外基质(包括CS)的能力，因而在骨基质蛋白尤其是CS与TGF间存在正反馈的相互作用，可推定CS能捕捉TGF和增加TG的活性，有效地促进成骨细胞分泌及加强对成骨细胞的影响。由于TGF多重生理特性，CS与TGF间的关系还可增加TGF对其他细胞的作用，在骨改建的过程中增加骨的形成。

1.2 CS调节细胞的作用 在细胞间的相互作用中，CS被看做是多用途的“黏合剂”，因其侧链具有多样性，使其能与多种分子相互作用[4]。能与细胞外基质成分结合，调节细胞与基质的结合，捕捉基质和细胞表面的可溶性因子，如生长因子，以促进成骨细胞的成熟。

1.3 CS与细胞粘附的关系 它与不同的细胞外基质分子、细胞-细胞粘附分子及生长因子的结合主要是依赖于其所带的负电荷极性。由于与细胞外基质分子的相互作用，细胞表面的蛋白多糖(proteoglycan，PG)能影响细胞的粘附[5]。细胞膜嵌入蛋白多糖，它带有硫酸肝素和CS链，能与胶原和纤维粘连蛋白结合，从而调节细胞的粘附。

1.4 CS在骨组织钙化过程中的影响 骨的矿化可被一系列的全身和局部因素影响，如激素水平，可利用的钙和磷的量、细胞合成功能、糖蛋白、磷蛋白、基质胶原、基质小泡等，这些因素及其相互间的关系尚不清楚，但部分学者认为CS在骨的矿化过程中起重要的调节作用。1935年Logan[6]观察到软骨转变成骨的过程中伴随着大量硫化成分的减少，认为无机盐在基质中的沉积依赖于CS，随后Sylven[7]也赞同这个观点并进一步强调CS的减少是软骨矿化所必须的。一些生化分析显示在矿化软骨中PG含量减少。De jong[8]对猪肩胛软骨的各个区域的分析得出矿化区的糖醛酸和氨基己糖含量最低，Lohmander[9]得出非矿化区的GAG含量比高度或局部矿化区域高近两倍。

1.4.1 CS吸附钙的能力 CS因由大量的带负电荷的硫酸和羧酸基团，能吸引阳离子在其周围聚集，已有一系列的的物理化学方法用来研究其与阳离子的粘附，但对粘附的方式存在争议，Mukherjee[10]认为CS中只有羧基基团与钙离子的吸附有关，McGregor[11]等认为CS中硫酸基团和羧酸基团在高浓度的钙溶液中都参与与钙的相互作用。进一步的研究认为，钙离子与羧基基团有位点(特异性)粘附，而与硫酸基团只有静电作用的粘附。HunterGK[12]还测定CS与钙的亲和力和粘附量，显示CS与钙的结合力很微弱(解离常数为14mM)，但有大的结合量(一个二糖单位约结合0.7个钙离子)，这些粘附的参数可用来估计软骨中粘附的钙含量，为简化起见，假设所有的GAG均为CS，血清中钙的浓度为2.5mM，软骨中CS的浓度为50 mg/ml，软骨中粘附的钙离子浓度为60 mM。由于其他阳离子的竞争(主要为NA+)[4]，且这种粘附力是微弱，钙易被竞争性的置换出来为矿化所利用。CS所粘附的钙离子为软骨基质的钙化准备钙的储存库。

1.4.2 CS在羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)形成中的作用 De jong[13]等泵动磷酸钙溶液流经聚丙烯酸膜来模拟体内环境，在膜内加入10 mg/mL的CS，结果增加磷酸钙晶相的沉积，因此在钙离子稳定环境下，CS是HA形成的促进剂。

1.4.3 CS促进矿化的机制 CS所结合的钙怎样被矿化组织利用，以前的观点是随着PG的降解，它所结合的钙被释放出来，目前新的观点认为CS中的钙是被置换出来的。Paige等[14]认为在矿化基质中存在离子交换，将软骨浸于钙溶液中，再浸入磷溶液中，组织基质摄入两种离子并有钙化的沉积，将两种反应顺序颠倒，就无沉积的发生。Dilek[15]利用胶原-CS复合体得出相似的结论，恰当的解释是钙离子与CS结合随后又被磷置换出来，从而升高磷酸钙的浓度积，超过沉积的阈值，同时CS吸附在胶原纤维表面为矿化提供成核位点，在这双重作用下很容易产生矿化沉积。

1.4.4 CS加速骨创的愈合 Moss等[16]拔出犬下颌双侧尖牙，实验组一侧放入浸于CS溶液(5mg/mL)的明胶海绵，对侧放入浸有生理盐水的海绵，在早期实验组比对照组有较多的新骨生成(4-6周)，而晚期实验组与对照组在骨修复上无区别(8周以后)，因而认为CS能加速骨修复的速度而不能影响最终骨形成的质和量。隋良朋等[17]将CS复合HA充填拔牙窝也加速拔牙窝的愈合，Masataka等[18]在尖周牙槽骨用根管扩锉造成缺损，用含CS的根充糊剂充填根管后发现含有CS的糊剂不仅可加速尖周骨质的愈合，而且在促进尖周牙槽骨改建上有较大的作用。Pieper等[19]用胶原和CS的混合物来充填牙周病的两壁袋骨缺损，发现胶原与CS的混合物能增多骨质形成量，并使新生骨质中的胶原排列的更有序。这些研究均表明CS有促进骨质矿化的作用。

2.CS在骨组织工程中应用

有研究证实[20-22]，胶原-HA-CS支架在体内的成骨能力好于胶原-HA支架。胶原-HA-CS人工骨的成骨速度、成骨范围及Ⅰ型胶原分泌量均优于胶原-HA人工骨。硫酸软骨素的添加有利于诱导成骨细胞的生长、增殖和粘附，且改善的骨诱导形成蛋白(BMP)承载系统，使BMP能在组织局部聚集成较高的浓度，从而有利于新骨的形成。作为骨缺损的替代物，胶原-HA-CS人工骨的力学性能和生物性能均优于胶原-HA人工骨。有研究[23]将以天然骨骼的3种基本成分—胶原、羟基磷灰石、硫酸软骨素，复合构建成三维多孔支架体系，再吸附以具有骨诱导活性的细胞因子BMP-2，形成骨修复材料。通过体外细胞种植和体内异位成骨，观察其生物相容性和骨诱导能力，并结合一系列的理化性能实验对其组成和结构进行分析。结果显示，胶原-羟基磷灰石-硫酸软骨素骨修复材料具有与天然骨类似的组成和微观结构，适于细胞粘附生长，生物相容性好，通过和骨形态发生蛋白结合，具有骨诱导活性，可进一步用于骨组织的修复。

3.展望

CS作为一种资源丰富性能优异的生物材料，因其特有的生物活性而广泛用于医学领域,被广泛应用于生物医学领域。作为组织工程材料，CS在骨、软骨、皮肤、肝、神经等组织均显示出一定的应用潜力[24]，但都存在一些缺点和不足。例如，作为支架材料，其力学强度、降解速度及与宿主间的结合能力均有待提高和优化。随生物医学领域和组织工程的发展，仿生材料的研究引起人们的关注。与基因治疗相结合成为研究热点。总之，CS在组织工程中的应用前景广阔。硫酸软骨素在其他方面的潜在应用有待开发。

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