羽衣甘蓝亲缘关系分析

常青

(辽宁省葫芦岛市园林管理处,辽宁 葫芦岛 125000)

1 引言

羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala f.tricolor Hort.)是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种,两年生草本花卉,又名叶牡丹。其叶形美观多变,心叶色彩丰富艳丽,耐寒性极强,是难得的秋冬季及早春室内外绿化的好材料,现在各地广为栽培[1]。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术是Williams[2]于1990年首先创立的一种DNA分子标记技术。它利用随机的10个碱基的寡核苷酸作为引物,对基因组DNA进行PCR扩增。这些扩增DNA产物片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性[3]。

本实验应用RAPD技术从64个随机引物中筛选出适宜的RAPD引物,对14种羽衣甘蓝新品种基因组DNA进行多态性研究,以分析羽衣甘蓝的亲缘关系,为今后配置更加合理的杂交组合提供分子依据。

2 材料与方法

2.1 供试材料

本试验采用从国内外收集的羽衣甘蓝新品种14份,作为供试材料。

2.2 实验方法

2.2.1 羽衣甘蓝总DNA的提取及检测

实验采用改进CTAB法提取羽衣甘蓝基因组DNA,将0.1g嫩叶在液氮中迅速研碎,取0.05g粉末迅速移入1.5mL离心管中,立即加入65℃预热的CTAB提取缓冲液500μ L,65℃水浴30min,期间颠倒几次;加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提2次。取上清液,加无水乙醇,-20℃放置 1h。10000r/min离心;弃上清,加入 TE溶解,颠倒混匀,然后再10000r/min离心;将上清液转入新1.5mL 离心管中 ,加入 RNase(10μ g/μ L),轻轻混匀后在37℃水浴1h;取出静置,冷却至室温后,加入1/10体积NaAc(pH5.2)和2倍体积无水乙醇,颠倒混匀后-20℃放置 1h。10000r/min离心;弃上清,用70%乙醇洗涤沉淀2次,放置超净工作台上吹干;加入 50μ LT E溶解;置于 4℃备用或 -20℃储藏。

提取的羽衣甘蓝基因组DNA通过凝胶电泳检测,加样于0.8%(m/v)琼脂糖凝胶(含核酸染料,0.5μ g/mL),在 LKB型电泳仪中电泳,并以 DNA分子量标准作对照,估测 DNA分子量。紫外灯365nm波长下观察、照相。

2.2.2 RAPD扩增

反应程序为94℃预变性5min;94℃变性30s,37℃退火30s,72℃延伸1min,40个循环;最后72℃延伸7min。原始20μ L反应体系:2μ LlO×PCR反应缓冲液;1.5mmol/LMgCl2;0.2mmol/LdNTP;0.3μ mol/L 引物;稀释 10 倍的总 DNA5μ L;1UTaq酶;灭菌的超纯水补齐体积到20μ L。以上药品均购自TIANGEN生物制剂(北京)有限公司,引物由宝生物工程(大连)有限公司合成,扩增反应在Whatman Biometra GmbH(Germany)公司生产的 TGradient Thermobolck扩增仪中进行。

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2.2.3 扩增产物分析

扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳,在紫外灯(TCP-15-M型)下观察并照相。将RAPD图谱上清晰稳定出现的条带记为“1”,同一位置没有条带记为“0”,将条带信息转换成由“0”和“1”组成的原始矩阵。应用DPS(version3.01)软件计算各材料间欧氏遗传距离,采用类平均距离法(UPGMA)构建聚类图,分析各品种之间的亲缘关系。

3 实验结果分析

3.1 提取基因组DNA质量检测

通过琼脂糖凝胶电泳,可以得出所提取的样品DNA在20kb左右,没有出现断裂和降解,因此,可用于PAPD的PCR扩增。进一步用紫外分光光度法测得OD260/OD280值均在1.8～2.0之间,表明用改良CTAB法所提取的DNA质量较高,可以满足下游的PAPD反应对模版纯度的要求。

3.2 RAPD体系优化

在原始RAPD反应体系基础之上,采用单因素法调整反应体系各组分的浓度,摸索建立更加适合羽衣甘蓝的RAPD反应体系。

3.2.1 模板浓度的影响

为确定适宜的RAPD分析的DNA浓度,试验设置6种DNA浓度梯度,依次为稀释1倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍。结果表明:模板浓度在稀释1倍和10倍时,扩增条带清晰,在稀释20倍以后开始模糊,稀释100倍和200倍时非特异扩增明显增加。所以本试验选取稀释 10倍的模板作为RAPD反应的浓度。

3.2.2 MgCl2浓度对RAPD扩增效果的影响

3.2.3 dNTP浓度对扩增的影响

dNTP浓度也是影响RAPD扩增的重要因素,试验dNTP浓度设置为 0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L。由图 4可以看出 dNTP浓度为0.05mmol/L、0.1mmol/L时无明显扩增条带,浓度为0.4mmol/L时条带清晰,扩增带数、带型和带的明暗程度都处于较理想状态,试验选取0.4mmol/L作为正式扩增条件。

3.2.4 TaqDNA聚合酶用量对RAPD的影响

试验设置了6个 TaqDNA梯度,0.5U、1.0U、1.5U、2.0U、2.5U、3.0U。试验结果表明:Taq酶具有很高的活性,在低浓度下也有扩增效果,但扩增量少。在1.5U时,条带清晰且亮度明显增强。随着用量增加条带亮度稍有增加,但逐渐有非特异扩增出现。所以确定Taq聚合酶浓度为1.5U。

3.2.5 引物浓度对RAPD扩增的影响

试验同时对引物浓度进行了优化,引物梯度设置 为:0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L。依据试验结果确定较适合的引物浓度为0.4mmol/L。最终确立适合羽衣甘蓝基因组的RAPD扩增反应体系为:2μ LlO×PCR反应缓冲液;2.0mmol/LMgCl2;0.4mmol/LdNT P;0.4μ mol/L 引物;稀释 10 倍的总DNA5μ L;1.5UTaq酶;灭菌的超纯水补齐体积到 20μ L。

3.3 引物的筛选

用优化后的反应体系,选取一个品系DNA对64个引物进行筛选。每个引物都有扩增产物,从中筛选出10条扩增谱带清晰、稳定且多态性好的引物用于聚类分析。

利用获得的RAPD标记,用UPGMA法建立了14份羽衣甘蓝新品种之间的遗传关系聚类分析图。在欧氏遗传距离为4.7处,14个品种分成4类。第1类4个品种,均为圆叶;第 2类 4个品种,为羽叶和圆叶;第3类5个品种,均为皱叶品种;第 4类为品种14,田间性状为皱叶白心。其中遗传距离最近的为3和4,欧氏距离值为2.449,这2个品系农艺性状都表现为皱叶粉心;聚类图中品系 2、3、4、5首先聚在一起,其农艺性状较近似,田间试验结果验证了这些材料的同源性很高,与聚类结果相一致;而品种14虽表现为皱叶,但其叶色和株型与其它皱叶品种有较大差异,所以与其它皱叶品种亲缘关系较远。

4 结语

从试验结果看,改良CTAB法提取得到的DNA其纯度和浓度均达到了RAPD反应对模板的要求。提取过程中有效去除较多的蛋白质和多糖类物质是保证高质量DNA的关键,针对羽衣甘蓝中糖及蛋白含量高的特点,本方法中用氯仿/异戊醇抽提两次,可有效地解决这一问题。

RAPD是利用寡聚核苷酸对基因组DNA进行多态性分析,检测区域几乎覆盖了整个基因组,因而可以检测不同品种间微小差异。从试验结果看,供试材料间存在较明显的差异,即使一些性状表现相近的品种间也存在多态性。因此,RAPD技术用于羽衣甘蓝品种间亲缘关系分析是可行的。

在RAPD聚类分析中,将羽叶品系和圆叶品系分别聚为一类,表现了田间试验与本试验的一致性。同时也看到聚类图中将羽叶品系13和圆叶9品系首先聚到一起后又和羽叶品系6在欧氏距离3.95处聚到一起,说明羽叶品系13和圆叶品系有较近亲缘关系。也可能说明 RAPD可以检测出叶型差异所造成的遗传差异,另一方面也说明可能筛选引物的数量还不足以完全检测出各品系间的差异。

[1]饶璐璐.羽衣甘蓝(kale)[J].蔬菜,1997(1):11～12.

[2]王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术[M].北京:科学出版社,1998.

[3]孙彩霞,张明永.中国兰属植物种间及品种间亲缘关系的RAPD分析[J].园艺学报,2005,32(6):1121～1124.