工业微生物混合发酵的研究进展

朱 博，李 强

（江苏科技大学，江苏 镇江212018）

1 引言

人类对微生物的利用经历了天然混合培养到纯种培养2个阶段。过去的多数发酵食品都来源于混合发酵，由于多菌发酵是一个完整的或接近完整的生物体系，体系中的微生物之间大多数具有生长代谢协调作用。自从纯种分离技术被广泛应用以来，人们研究的重点、焦点似乎都在单一的菌种上，忽略了天然发酵的模式，那就是生存环境的完整性和协调性。利用混合菌种发酵生产饮料正是利用几千年以来各菌种之间的共生性。纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，能够不受干扰地对单一目的菌株进行研究，从而丰富了我们对微生物形态结构，生理和遗传特性的认识。但是，在长期的实验和生产实践中，人们不断地发现很多重要生化过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行的，必须依靠两种或多种微生物共同培养完成。微生物混合培养或混合发酵已越来越被人们所重视。

2 混合发酵生产功能性饮料

目前混合发酵在功能性饮料的开发和生产方面有广泛的应用。根据国际饮料行业协会的新规定，功能性饮料是指具有保健功能的软饮料。目前市场上的功能性饮料主要分为3类，即运动饮料、能量饮料和其他饮料，其大多含有氨基酸、矿物质，以及各种维生素等人体所需物质。这些饮料的开发多数采用了混合发酵技术，也有部分是采用直接从生物体提取和单菌发酵方法的。随着我国经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，饮料消费迅速增加。据有关资料显示，1980年我国饮料产量仅28万t，1995年则猛增到1 000万t，2005年达到2 000万t，25年间平均以26.7%的速度增长。如此巨大的饮料市场，发酵功能性饮料必须占有一席之地。据国家统计局、中国饮料工业协会、中国食品工业协会、中国海关、中国经济信息中心、中国竞争情报网、中国食品商务网、全国及海外500多种相关报纸杂志的基础信息等公布和提供的大量资料显示，中国饮料市场成为中国食品行业中发展最快的市场之一。2003年中国饮料产量2373万t，比2002年增长16.84%。实现工业总产值（当年价）813.87亿元，销售收入774.42亿元，分别比上年增长40.12%和40.41%。以“红牛”“脉动”等新一代品牌为代表的功能性饮料已被广大消费者所接受，并在健康潮中掀起一股功能性饮料的热潮。就我国目前的饮料市场来看，功能性饮料正处于黄金发展时期，具有极大的开发空间［1］。

3 微生物混合培养生产药品

3.1 维生素的混合发酵生产

维生素C二步发酵是混合发酵的典型实例。这种方法是由中科学院微生物所和北京镧药厂合作，于20世纪70年代初发明的。其第2步发酵由氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌等伴生菌混合发酵完成，其中小菌为合成维生素C前体2-酮基-L-古龙酸（2KGA）的菌株，但很难单独培养，且单独培养产酸能力很低；大菌单独培养容易，但不产生2-KGA，与小菌混合培养时不仅可促进小菌生长，而且能大大增强小菌的产酸能力［2］。能与小菌混合培养合成2-KGA的伴生大菌有很多，除巨大芽孢杆菌外，还有蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌等，某些酵母亦有该作用。有关研究表明，大菌为小菌提供某种生长因子促进其生长，并且提供某些生物活性物质协助小茵合成2-KGA，二菌混合培养呈互生关系［3］。通过调节二菌比例、pH值、温度及溶氧量等因素，可使混合菌达到较适的生态状态，发挥较高的生产效能。二者间的关系和作用机制正在进一步深入研究中。此外维生素B12可利用谢氏丙酸杆菌和马铃薯芽孢杆菌或大肠杆菌的混合培养生成。

3.2 抗菌肽的生产

乳酸菌素是一种由乳酸菌属菌株产生的抗菌肽类，可抑制多种革蓝氏阳性菌的生长，已被50余个国家用作食品保鲜剂［3］。1999年Shimizu等［4］报道，以Lactococcus lactis和Kluyveromyces marxianus混合培养可有效地生成乳酸菌素，这主要是由于Kluyveromyces marxianus可通过消耗前者产生的乳酸控制发酵体系的pH值，从而使乳酸菌素的产率维持高水平。

3.3 甾体转化

多种甾体类药物的转化也是利用混合菌培养实现的。诺卡氏菌和节杆菌培养用于5α-Δ9（11）-16β-甲基-3β，17α，21-羟基-孕甾烯-3β，21-双醋酸酯-20酮和5α，17α-甲基-17β羟基-雄甾-3酮的1，4位上的脱氢转化［4］简单节杆菌和玫瑰产色杆菌的混合培养也可用于甾体转化。

4 微生物混合培养用于生物降解

蛋白质是配合饲料中的主要营养成分，一般占20%左右。随着畜牧业的迅猛发展，对饲料蛋白的需求量日益增加。因此寻求新的饲料蛋白来源便显得十分重要。我国薯类作物产量很高，但因其本身蛋白含量很低，直接用作饲料其生物效价不高通过微生物转化技术可由丰富的薯类资源得到菌体菌蛋白饲料，从而可在一定程度上缓解日益突出的饲料蛋白短缺问题。对淀粉质原料而言，通常采用的工艺是原料先经酸法或酶法糖化等预处理，将淀粉降解为可发酵性糖，然后再接种相应的高蛋白产生菌合成微生物菌体蛋白。为简化生产工艺，直接采用具有淀粉分解能力的菌种发酵生产蛋白饲料已日益受到重视。

我国是蛋白质饲料资源短缺的国家，目前蛋白质饲料年缺口约为1 500万t。据预测2010年到2020年我国蛋白质饲料资源需求分别为6 000万t和7 200万t［5］。目前我国发酵工业的废菌渣和糟渣类农副产品下脚料以及废弃物大多没有充分利用，这不仅造成资源浪费，而且造成环境污染［6～13］。现在生产主要是以食用菌生产过程中的废菌渣为主要基质，筛选适合分解利用废菌渣的多种大型食用真菌和酵母菌，采用单独培养和混菌共同发酵工艺来生产饲料蛋白，以实现废弃物质资源化和物资的循环再生，减少环境污染。

4.1 对原油的降解

生物修复是治理土壤石油污染的重要方法，主要原理是微生物利用石油作为碳源进行同化降解，使其转变为无害的无机物质。据文献报道，单菌株所能代谢的石油组分有限，大多数石油降解菌株只能代谢一种或几种石油烃。但经过混合菌对原油的降解及其降解性能的研究，发现经驯化后的烷烃降解菌GS3C、菲降解菌GY2B、芘降解菌GP3A和GP3B对原油都具有一定的降解效果。GS3C能基本去除原油中的直链烷烃化合物，GP3A对C＜25的中短链烷烃化合物有较好的降解效果。构建的混合菌组G1、G3、G8、G11的降解效果较单一菌株有明显的提高，去除率都达到了50%以上，能基本去除原油中的直链烷烃类化合物［14］。

4.2 对生活垃圾的降解

世界每年产生大量生活垃圾，处理方法主要是堆埋和焚烧，占用土地和浪费能源，既污染环境又带来一定危害。生活垃圾在经过发酵后可作为有机肥料，但在一般条件下，其发酵时间长且肥效低，影响了其实际应用［15］。

有研究表明纤维素分解菌可混合培养，自生固氮菌利用纤维素分解菌分解纤维产生的葡萄糖作为碳源，纤维素分解菌利用固氮菌固定的氮作为氮源，两者相互利用、相互依存，进行生长和繁殖。两者混合培养的菌数和发酵液总含氮量明显高于各自单独培养。自生固氮菌与纤维素分解菌的混合菌液作用于生活垃圾，可大大提高生活垃圾的降解速度，同时其降解物的含氮量也有明显的提高。用这种方法处理生活垃圾既可以提高生活垃圾的降解速度又使其含氮量增加，提高了肥力，同时其降解物中含有大量的有生物活性的固氮菌及纤维素分解菌，所以是一种优良的生物活性肥料。将其施用于土壤中，既增加土壤的肥力，又增加土壤中固氮菌及纤维素分解菌的数量，有利于土壤中有机质的分解及土壤自生固氮，进一步增加土壤肥力，改良土壤，减少化肥的施用，有利于环境保护［16］。

4.3 氨基多糖生物降解氨基多糖

氨基多糖主要以几丁质和脱乙酰几丁质的形式存在于节肢动物外骨骼和真菌细胞壁中，在自然界中的含量仅次于纤维素。利用微生物对氨基多糖进行降解和转化，有可能生成具有生物功能的活性糖蛋白。王士奎以Beauveria Bassiana LB90为氨基多糖降解菌，以Candida sp.LB50作为氨基糖转化菌，建立了氨基多糖混合菌生物降解和转化模型。与纯培养比较，粘度下降比率提高23.0%，可溶性糖含量增加167.7g／mL，两菌呈互生关系［17］。

5 混合发酵开发清洁新能源

5.1 沼气发酵中的作用

沼气发酵是由多种产甲烷菌和非产甲烷菌混合共同发酵完成的。我国是农业大国，每年产农作物秸秆7亿t以上，禽畜粪便大约1.4亿t。随着农村经济发展和农业结构调整，牲畜养殖已经由过去的农户分散养殖过渡为集中养殖，并且大多集中在大城市附近，这必将造成农村户用沼气池发酵原料的短缺。因此，寻求新的发酵原料将是亟待解决的问题。然而单一以秸秆作为发酵原料，由于其碳氮比高、速效养分含量低、纤维木质素含量高，表面有一层蜡质，不利于微生物的附着，且降解率低、厌氧消化时间长、易出现漂浮分层，一直不能被广大农民所接受。将粪便和秸秆混合发酵，可以有效弥补秸秆作为发酵原料的弊端［18～19］。

5.2 乙醇发酵

作为可更新可持续的生物能源，生物酒精是经济高速发展过程中替代传统石油燃料能源的最佳选择之一。把纤维素作为可更新资源通过微生物降解转化生成糖类，然后糖类进一步发酵转化成液体燃料具有广阔的应用前景［20～23］。然而，纤维素酒精的规模工业化生产还面临很多严峻的实际问题，其主要问题之一就是微生物对纤维素的降解效率以及糖类发酵转化成酒精的效率太低［20，21］。研究表明，热纤维梭菌（Clostridiumthermocellum）是一种高效的纤维素降解细菌，但其酒精生产效率较低［22，23］；嗜热厌氧乙醇菌（Thermoanaerobacterethanolicus）不能降解纤维素，但其能够有效的发酵糖类而转化为酒精。因此对两者进行混合培养，可以利用热纤维梭菌高效降解纤维素转化成糖类，然后糖类可以作为嗜热厌氧乙醇菌的底物通过发酵转化成酒精，这样一个稳定的混合培养体系可以作为纤维素酒精工业化生产微生物群落较好的选择。本研究主要以热纤维梭菌和嗜热厌氧乙醇菌为对象，以Solka Floc为底物纤维素，系统分析了热纤维梭菌纯培养以及热纤维梭菌和嗜热厌氧乙醇菌混合培养对纤维素酒精生产能力、纤维素降解能力及终产物分布的影响，以期为纤维素酒精工业化生产提供理论依据。

6 结语

虽然微生物混合发酵技术的部分成果已成功应用于部分工业生产，但在大多数混合菌体系中，菌间相互作用机制和发酵产物对于各种混合菌之间的影响的研究还很少。同时对于菌株混合时的安全性还没有系统的评估和研究。混合发酵关键是摸索pH、温度、混合比例、菌株混合时间等多菌种的共同培养条件，从而确定菌株发挥最大协同作用的结合点。为了使混合发酵能够更好地应用于工业发酵生产，使其最终具有良好的大规模生产的工业应用前景。针对目前混合发酵的随机组合和盲目的发酵实验，需要深入研究并且建立快速有效的混合菌发酵模型是非常必要的。因此，如果从生理、代谢和遗传角度对混合菌间关系和协同作用机制进行深入研究，对混合菌培养的理论和应用都将有巨大的突破。所以未来的研究重点可能集中在多菌组合模式、筛选适合菌株，并且优化混合培养的条件。混合发酵有广阔的发展空间，在工业发酵中如果得以合理的运用，就必定可以提高生产效率与产品质量，为实现绿色无污染生产提供了新的发酵模式。

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