植物脂肪酸及其相关代谢酶的研究进展

冯亚莉,侯智霞

(北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室,北京100083)

1 植物脂肪酸的生理功能

脂肪酸生物合成是机体基本代谢之一,合成途径及其调节研究不仅具重要的理论意义,还有广泛的应用前景,如利用基因工程技术生产有用脂肪酸、改善油和脂肪的品质、增加机体的抗逆性及设计除草剂等。

1.1 植物脂肪酸与植物的抗寒性

甘油脂中的不饱和脂肪酸是生物膜功能所必需的。当催化不饱和脂肪酸合成的酶发生突变时,植物体内不饱和脂肪酸减少,抗寒性减弱。国外Somerville和Brow se以拟南芥为材料,对拟南芥叶绿体sn-2-棕榈酰去饱和酶和△12-去饱和酶基因突变体fad5和fad6,在低温下叶片黄化,生长变缓,叶绿体形成也发生改变,同样其微粒体△12-去饱和酶基因突变体fad2的耐低温能力也减弱[1]。

1.2 植物脂肪酸与植物的抗病性

脂肪酸去饱和作用是植物防御反应中的一个重要组成部分。如真菌感染和肽激发子Pep25可诱导微粒体△12-去饱和酶和质体ω3-去饱和基因快速和短暂表达[2],催化α-亚麻酸形成。这些α-亚麻酸作为细胞信号分子茉莉同算的一个重要前体[3],引起茉莉酮酸的积累[4]。又如超长链脂肪酸主要存在与某些种子油中或位于植物表面是蜡、角质、木栓质的组成部分并参与组成和碳水化合物,乙醇、乙醛的合成[5]。其中植物体表面的蜡是植物防御体系的重要组成部分,在防止病原物侵染、草食性昆虫及抵御环境胁迫如干旱、紫外线破坏和霜冻中发挥重要作用。

1.3 植物脂肪酸的食品及工业价值

人体内可以合成饱和与不饱和脂肪酸,但不能合成维持机体正常生长所需的一些脂肪酸(称为必需脂肪酸),如亚油酸和亚麻酸等。它们只能从食物中获得。随着生活水平的提高,植物油的饱和脂肪酸含量较动物脂肪酸少50%左右,使人们对脂肪酸的摄入由动物脂肪逐渐转向植物油。进而对饱和脂肪酸含量低、不饱和脂肪酸含量高的植物油的需求逐渐提高。除食用外,脂肪酸还是生产油酸,润滑剂、尼龙等化工产品的重要原料。据统计,世界上每年有1/3的植物油用于制药和化工生产[7]。

2 脂肪酸的种类和重要性

2.1 饱和脂肪酸的生物合成酶和基因

脂肪酸合成的前体为乙酰-CoA。它首先在乙酰-CoA羧化酶的作用下合成丙二酸-CoA。然后脂肪酸合成酶以丙二酸-CoA为底物进行连续的聚合反应,以每次循环增加2个碳的频率合成酰基碳链,进一步合成16～18个碳的饱和脂肪酸。高等植物中饱和脂肪酸的合成,主要是在胞液中合成的,线粒体也能合成。此外,微粒体和叶绿体也具有微弱的脂肪酸合成功能。

2.1.1 乙酰-CoA羧酸化酶(ACC)

ACC是脂肪酸生物合成过程中的关键之一,生物体内共发现有两种形式的ACC。一种是多功能酶,在一条多肽链中含有3个功能结构域,催化多个反应进行,被称为真核形式的ACC,分子量为220～240kpa,与动物和真菌的多功能酶类似,它们只是ACC的微量形式,其活性占叶片总ACC活性的20%,且主要位于表皮组织。单子叶植物种的禾本科植物属于真核形式的ACC,它们对一些除草剂非常敏感[8]。植物中还发现另一种ACC不位于叶片叶绿体,对除草剂不敏感,其功能有待进一步研究。乙酰-CoA羧化酶另一种为多酶复合体形式,位于质体,类似原核生物的多酶复合体,它可解离成多功能蛋白,如生物素羧化酶、生物素羧基载体蛋白、羧基转移酶及另一个功能未知的酶,被称为原核形式的ACC。双子叶植物如豌豆。烟草等叶绿体ACC为原核形式。双子叶植物细胞质ACC则可能是真核形式。若要改变种子中的ACC活性,不仅要利用反义RNA调控真核形式的ACC多功能酶,更重要的是调控原核形式的ACC多酶复合体[9-15]。

植物ACC受光合脂酰-CoA调节,光可能通过改变基质PH、ATP、ADP和镁离子等参数来调节酶活性,增加叶片脂类形成,从而影响脂肪酸合成。脂酰-CoA对ACC起抑制作用,很可能通过抑制基因表达来实现[16,17]。

2.1.2 植物脂肪酸合成酶(FAS)

植物FAS为原核形式的多酶复合体,由酰基载体蛋白、β-酮脂酰-ACP脱水酶、β-酮脂酰-ACP合酶、β-酮脂酰-ACP-还原酶、烯脂酰-ACP还原酶、脂酰-ACP硫脂酶等部分构成。酰基载体蛋白在植物体内存在多个ACP同工酶,大麦有3个,分别为 ACP-Ⅰ、ACP-Ⅱ 、ACP-Ⅲ,由Acl2和Acl3基因编码。同样在菠菜、拟南芥、蓖麻、油菜籽中均有研究[18,19]。同植物ACP受光调节和种子发育时进行表达。β-酮脂酰-ACP合酶发现有三种KASⅠ 、KASⅡ 、KASⅢ3种,它们分别对乳霉素和浅蓝菌有不同程度的敏感。催化不同碳原子数的脂酰-ACP的缩合。缩合反应启始的底物乙酰-ACP的合成可由单独的乙酰-ACP的ACP转酰基酶催化,也可由KASⅢ催化。另一底物丙二酰-ACP由丙二酰-CoA：ACP转酰基酶催化产生[20,21]。植物β-酮脂酰-ACP-还原酶有两个等位形式,已从菠菜和鳄梨油菜中纯化。植物烯脂酰-ACP还原酶有两种等位形式,一种为NADP特异的烯脂酰-ACP还原酶,已从油菜中纯化,具有α4结构,每个亚基 35KD,编码基因也已克隆,另一种NADP特异的烯脂酰-ACP还原酶。脂酰-ACP硫脂酶催化FAS循环的终止,已从多种植物中纯化,编码基因也已从红花、油菜和拟南芥等多种植物种克隆[22,23]。

2.2 不饱和脂肪酸的生物合成酶

生物体内饱和脂肪酸可在脱饱和酶的作用下形成不饱和脂肪酸,包括棕榈油酸和油酸等单不饱和脂肪酸及亚油酸和亚麻酸长链多聚不饱和脂肪酸。棕榈油酸和油酸分别是有软脂酸和硬脂酸在作用于碳链的第9个和第10个碳原子之间引入双键的脂肪酸脱饱和酶而形成。△9-脂肪酸脱饱和酶是脱饱和途径的关键酶,油酸脱氢酶FAD2是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶。单不饱和脂肪酸可进一步形成多聚不饱和脂肪酸,如油酸在ω6-,ω3-和ω6-脂肪酸脱饱和酶的催化下可分别形成亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸。多数高等植物只合成γ-亚麻酸,只有少数植物产生x-亚麻酸。虽然高等植物合成多种不饱和脂肪酸,但膜脂中大多数不饱和脂肪酸的双键位于十八碳脂酰链的△9,△12、△15位于对应的十六碳脂酰链的△7,△10,△13。植物脂肪酸脱饱和作用在叶绿体或内质网上进行[24]。脂肪酸脱饱和酶主要是催化与载体结合的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸在脂酰链形成双键。该酶在决定贮脂与膜脂的脂肪酸组成与不饱和度、控制生物膜的形成与物理性质,保护光合机构等方面起关键作用,同时也是不饱和脂肪酸合成途径的关键酶,分离和鉴定这些酶基因有重要的意义。

2.2.1 脂肪酸脱饱和酶的种类和分布

目前主要是通过操纵TAG的生物合成来直接改变油的成分,已鉴定出的主要酶类有两种：脂肪酸修饰酶和TAG组装酶。脂肪酸修饰酶类是脂肪酸脱饱和酶。植物油种饱和脂肪酸的含量远低于动物脂肪酸。棕榈酰-ACP在脂肪酸代谢过程种是一关键底物,其碳链既能被3-酮酯酰ACP合成酶进一步延长,也可以在乙酰-ACP硫酯酶作用下脱ACP形成棕榈酸并转化为贮存态油,因此植物中饱和脂肪酸的含量主要是由3-酮酯酰ACP合成酶和硫酯酶活性所决定[25]。不同生物体中脂肪脱饱和酶可以根据它们的底物特异性、细胞内定调节模式加以划分,脂肪酸脱饱和酶的种类和分布,根据其所作用的底物脂肪酸结合的载体不同可分为3类[24]。

(1)脂酰CoA脱饱和酶。它存在于动物、酵母和真菌细胞中,与内质网相结合,催化以CoA为载体的脂肪酸形成双键。

(2)脂酰ACP脱饱和酶。它存在于植物质体基质,催化与ACP结合的脂肪酸形成双键。

(3)脂酰-脂脱饱和酶。它存在于植物内质网膜、质体膜和蓝藻类囊体膜上,催化与甘油脂结合的脂肪酸形成双键,这一类脱饱和酶是膜脂不饱和程度响应温度变化最有效的调节器。脂酰-脂脱饱和酶可能根据电子供体不同分为两类。一类是定位于植物细胞的内质网,以细胞色素B5为电子供体。另一类存在与植物细胞质体和蓝细菌中,以铁氧还原蛋白为电子供体。

脱饱和酶还可以根据其在脂肪酸链形成双键时参考点的不同分为两种类型：A型脱饱和酶朝向羧基端以亚甲基间隔模式形成双键。ω-型脱饱和酶则朝向甲基端[26]。

2.2.2 脂肪酸脱饱和酶

(1)植物脂酰ACP脱饱和酶。植物脂酰ACP脱饱和酶定位于植物质体中,是植物中唯一可知的可溶性脱饱和酶家族。目前研究最多的,就是植物硬脂酰ACP脱饱和酶(SAD)。目前已从蓖麻、大红花、黄瓜、油菜、菠菜、土豆、亚麻、葡萄和芝麻等植物种分离获得。植物硬脂酰ACP脱饱和酶催化结合与ACP的特定长链饱和脂肪酸在特定位置形成双键,是植物典型不饱和脂肪酸生物合成途径的第一步脱饱和,因此直接调节了膜脂与贮脂种的饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例。植物硬脂酰ACP脱饱和酶催化硬脂酰ACP在第9-10碳原子之间脱氢形成了双键,产生油酰ACP[27]。

(2)植物脂酰-脂脱饱和酶。脂酰-脂脱饱和酶主要是存在与蓝藻植物中,膜结合蛋白,故采用常规生化方法难以鉴定,目前主要采用直接克隆相关基因的方法。植物中存在这两套膜结合脱饱和酶,分别定位于质体和内质网膜。通过采用图位可供发和插入图变法首先克隆成功拟南芥的相关酶。研究人员又在菠菜、大豆种也提炼出来。除此之外从稻米、青豆、蓖麻、小麦和烟草等植物也分离克隆了内质网和质体定位的脱饱和酶基因。脱饱和酶基因对植物激素和环境刺激包括光,温度和受伤等有不同的反应[28,29,30]。

(3)脂酰CoA脱饱和酶。存在与动物、酵母和真菌细胞中,目前也有相关研究,本研究以植物为主,所以我们不多做介绍了。

2.2.3 超长链脂肪酸的生物合成及相关酶

脂肪酸从头合成脂形成软脂酸,要合成链长为20～30碳或更长的饱和或不饱和超长链脂肪酸,必须由膜结合的脂肪酸延长酶系统继续把碳链延伸。对超长链脂肪酸生物合成的研究是近几年逐渐受重视的,研究尚不深入。

3 结语

脂肪酶是油脂分解代谢过程中的重要酶类,在植物脂肪酶基因的克隆、表达分析和体外表达报道较少,尤其是油料作物脂肪酶基因的相关报道更少。在脂肪酸去饱和过程研究中,仍然无法对该过程涉及的一些细节提出合理解释或给出实验证据。在对脂肪酸去饱和酶及其基因研究中,对储油果实的研究较少。储油果实中加强该方面的研究不仅可以扩大优质油脂的育种资源,而且对于改良油料作物的脂肪酸组成和提高含油量也具有一定的参考价值。

随着研究手段的不断进步,人们对不饱和脂肪酸合成过程的了解会逐步深入,并且随着对这些基因表达规律的认识的进一步深入,人们对植物种子脂肪酸组成的定向改良也会更方便、有效。

[1]Somerville C R,Brow se.Plantlipids;metabolism,mutanl,andm emb ranes[J].Science,1991(252)：80～ 87.

[2]Brow se J.M c Coon M,Jam es Jr.Mutants of A rabidopsis deficien t in the synthesis a-linolenate.Biochem ical and genetic chaactrization of the end oplasm ic reticulum linoleoyldesatu rase[J].JBiol：Chem,1993(268)：16 345～ 16 351.

[3]M ique lM,Brow se.A rabidopsismutants deficient in polyunsaturated fatty acid synthesis.Biochem ical and genetic characterization of a plant oley l-phosphatidylcholine desaturase[J].JBid Chem,1992(267)：1 502～ 1 509.

[4]K irsch C,Hahlb rock K,Somssich LE,Rapid and tesnsient inducation of a parsley m icrosomal delta 12 fatty acid desatu rase m RNA by fungal elicitor[J].Plant PH ysiol,1997(115)：895～909.

[5]Blecher tS,Brodschelm W,H older S,Kammerer L,et al.The octadecanic pathw ay：singalmolecu les for the regulation of secondary pathw ay s[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992(92)：4 099～4 105.

[6]周奕华,陈正华.植物种子中脂肪代谢途径的遗传调控与基因工程[J].植物学通报,1995(5)：16～ 23.

[7]Bell E,Creelman RA,M ullet.A chloroplast liparygenase is required forwound-induced jasm onicacid accumu lation in A rabdopsis[J].Proc Natl Acad Aci USA,1995(92)：8 675～ 8 679.

[8]Beittenmitler D,Roughan PG,Ohlrogge JB,Regu lation of plant fatty acid biosynthesis.Analysis of acy l-Coenzyme A and acyl-acylcarrier protein substrate pools in spinach and pea chloroplasts[J].Plan t Physiol,1992(100)：923～ 930.

[9]Harw ood J L.Recen t advances in the biosynthesis of plant fatty acids[J].Biochim Biophys Acat,1996(1 301)：7～ 56.

[10]Ashton A R,JenkinsC L D,W hitfield P R,Molecular c loning of tw o different cDNAs fox Maize acetylCoA carboxlylase[J].PlantA l Biol,1994(24)：35～ 49.

[11]Gon rickiP,H aselkom R,W heat acetyl-CoA carboxylase[J].Plant M olBiol,1993(22)：547～ 552.

[12]Sasaki Y,H akamada K,Suama Y,Nagano Y,etal.Ch loorplast-encoded p rotein as a subunit acety-CoA arboxylasein pea plan t[J].BiolChem,1993,26(8)：25 118～ 25 123.

[13]Mackintosh RW,Hardie D G,Slabas A R,A new assay procedu re to study theinduction ofβ-ketoacyl-ACP synthase Iand II,and the complete purification ofβ-ketoacyl-ACP synthase I from developing seeds of oil seed rape(Brassicanapus)[J].Biochim Biophys Acta,1989,1(2)：114～ 124.

[14]Shanklin,J,C.Somerville.Stearoyl-acyl-carrier-porteind esaturasef rom higher plants is stm cturallyun related to the animal and fungal analogs[J].Proc Natl Acad,1991(88)：2 501～2 514.

[15]Page R A,Okada S,H arw ood J L.Acetyl-CoA carboxylase exerts strong flux control over lipid synthesis in p lan ts[J] .Biochim Biophys Acat,1994(1 210)：369～ 372.

[16]AorndelV.M ap-based c loning of a gene controlling omega-3-fatty acid desturation in A rabidopsis[J].Science,1992(28)：1 353～1 354.

[17]Voelker T.A.Fatty acid biosynthesiser directed to m edium chains in,transgenic oilseed plants[J].Science,1992(257)：72～74.

[18]Verw oertII,vanderLinden K H,Nijkam p H J,et al,Developmental specific expression and o rganelleta rgeting of the Escherichia coli fabD gene,encodingmalonylcoenzyme A-acy l carrier p rotein transacylase in transgenic rape and tobacco seeds[J].Plan t MolBiol,1994(26)：189～ 202.

[19]Siggaard-Andersen M,Kauppinen S,Von W ettstein Know les P.Primary stru cture of a cerulenin bindingβ-ketoacyl[acylcar rier portein]s y rrthasefr omb arleych loorplasts[J].Proc Natl AcadS ciU SA,19 91(88)：4 114～ 4 118.

[20]Reith M,A p ketoacyles-acylcarrier p rotein syn thaselI gene(fabH)is encoded on the chloroplast genome of the red alga Por phyra umbilicalis[J].Plan t MolBiol,1993(21)：185～ 189.

[21]Dormann P,VoelkerT A,OhlroggeJB.Cloning and exp ression in E scherichia coli of anovel thioesterase from A rabidopsis thaliana specifio for long chain aryl-acylcarrier porteins[J].A rch Biochem Biophys,1995(316)：612～618.

[22]H ellyerA,Slabas A.Acyl-[acylcarrierp rotein]thioesterase from oil seed rape：purification and characterization.In：Plant Lipid.B iochernistrv Structuer and U lization Quinn P.J.Harw ood.[J]Leds.Portland.Perss Lim ited.London,1990(7)：160～162.

[23]卢善发.植物脂肪酸的生物合成与基因工程[J].植物学通报,2000,17(6)：481～491.

[23]YadavN,WierzbickiA.know ltonS etal.In：N M urata,CRSomerville,ed s.Biochem istry and molecular biology of mem brane and storage lipidsof plants[J].Rockville,MD：American society of plan t physiologists,1993(70)：60～ 61.

[24]Cohenz,Shirand,Khozini,Etal.Fatty acid unsaturation in the red algaporphyridium ruentum[J].Biochimbiophysacta,1997,1 344(1)：559～ 622.

[25]M ckeon T A,Stmnpf P K .Pu rificatoinand characterization of the s tearoyl-Acylcanier protein Desatu rase and theacy l-Acylcarrier protein thioesterase from maturing seed s of safflower[J].Biol Chem,1982,257(20)：1 214～ 1 217.

[26]Ligh terJ,W uj,Brow seJ.A mu tant of arabidopsisw ith increased level of stearic acid[J].Plant physiol,1994(106)：1 443～ 1 454.

[27]JYukaw a Y,Takaiw a F,Shojik k,etal.Structure and ex pression of tw o seed-Specific cDNA Encoding stearoyl-Acylcarrier protein desatu rase from sesame,S esam umindicum[J].Plan t Cell physiol,1996,37(2)：201～ 205.

[28] Reddy AS,Muccio M I,Gross LM,etaL Isolation of△6desaturase gene from the cyanobacterium Synechocystissp.Stra in PCC6803 by gain-of-funciton expression in Anabaenasp,strain[J].Plant Mol B io1,1993(27)：293～ 300.

[29]Nishiuchi T,Nakam ura T,Abe T,etal.Tissue-specific and light responsive regu lation of the promoter region of the A rabdop sis th aiiana chloorplasttω3 fatty acid desatu rase gene[J].Plan t Mol Biol,1995(29)：599～ 609.

[30]HoriguchiG,Iwakawa H,Kodam a H,etal.Exp ression of gene for plastidω3fatty acid desatu rase and changes in lipid and fatty acid com posiiton sin light-and dark-grow n w heat leaves[J].Physiol Plant,1996(96)：275～ 283.