抗结核特异性转移因子主要有效成分研究

潘建超* 薛东升 张文明

（上海凯宝药业股份有限公司，上海 201401）

主要生物分子物质含量测定和分析。

1 脂肪类物质检测

用高效薄层层析色谱法[1]，对样品进行分析，然后分别用碘熏蒸法显色和间苯二酚-盐酸溶液显色检测样品中中性脂和糖脂含量。

1.1 检测方法

①层析板预处理：取硅胶G薄层板于130℃活化1h。②层析：取供试品用全自动点样仪上样，斑点直径＜0.5cm，凉干，作4个上样点，置展开缸中展开。展开剂为氯仿∶甲醇∶0.2%CaCl2（55∶45∶10）。③显色：每两个上样点为一组，取一组硅胶板，用喷瓶喷洒间苯二酚-盐酸溶液[取间苯二酚2g溶于蒸馏水100mL中，取10mL 2%间苯二酚水溶液加80mL 36%浓盐酸（含0.25mL 0.1mol/L硫酸铜）加水定容到100mL，使用前4h配制]，喷后即加玻璃片封盖，110℃显色20min。取另一组硅胶板，置一个密闭玻璃容器内，加入少量碘，稍微加热使碘变为碘蒸气，熏蒸5min。

1.2 测定结果

用薄层色谱分析，样品在两组薄层板均无显色条带出现，说明样品中不含中性脂肪类物质和糖脂类物质，而阳性对照品中性脂（大豆卵磷脂）和糖脂（单唾液酸四己糖神经节苷脂）皆出现明显显色条带。

2 糖类物质含量测定

用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法[2]和地衣酚法[3]对样品进行总糖和核糖含量测定。

2.1 总糖含量测定

①葡萄糖溶液的制备：精密称取葡萄糖约10.0mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，精密吸取1mL置5mL量瓶中，加水至刻度，即为200μg/mL的葡萄糖溶液，临用新制。②二硝基水杨酸（DNS）试剂配制：称取DNS 1g，苯酚0.2g，亚硫酸钠0.05g，氢氧化钠1g，酒石酸钾钠20g，加水溶解并稀释至100 mL即得。③样品溶液：取原液用注射用水稀释2倍即得。④测定法：取葡萄糖溶液、水和样品溶液于10mL玻璃试管中，混匀，分别加入3mL的DNS试剂，置沸水浴中加热15min，放冷，用水稀释至10mL，摇匀，照分光光度法测定550nm处吸光度。⑤结果计算：用葡萄糖对照品溶液浓度对其相应吸光度作直线回归（R2应≥0.99），由直线方程求出样品溶液总糖含量。

2.2 核糖含量测定

①D-核糖溶液的制备：精密称取D-核糖约10.0mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，从中精密量取1mL，置5mL量瓶中，加水至刻度，即为200μg/mL的D-核糖溶液，临用新制。②三氯化铁-盐酸溶液配制：称取三氯化铁（FeCl3·6H2O）0.5g，加浓盐酸溶解成500mL，即得。③地衣酚试剂：取1g重结晶地衣酚用95%乙醇溶解定容至10mL即得。④样品溶液：取原液用注射用水稀释2倍即可。⑤测定法：取D-核糖溶液、水和样品溶液于10mL玻璃试管中，混匀，分别加入1mL的三氯化铁-盐酸溶液，然后再加入0.1mL的地衣酚溶液，置沸水浴中加热40min，放冷，用水稀释至5mL，摇匀，照分光光度法测定670nm处吸光度。⑥结果计算：用核糖对照品溶液浓度对其相应吸光度作直线回归（R2≥0.99），由直线方程求出样品溶液核糖含量。

2.3 测定结果

结果显示，葡萄糖溶液和核糖溶液线形关系很好（图1），R2＞0.99。根据测定结果带入各自直线方程计算和乘以样品稀释倍数，样品溶液中总糖含量为255.3μg/mL，核糖含量为198.0μg/mL。结果显示样品中核糖含量占总糖含量的77.55%，说明样品糖类物质主要以核糖为主。

图1 抗结核特异性转移因子原液糖类物质测定标准曲线和直线方程

3 核酸检测

用琼脂糖平板法[4]测定样品中核酸含量，用紫外扫描分析最大紫外吸收波长。

3.1 测定方法：①琼脂糖核酸电泳：配制2%琼脂糖平板，含0.5μg/mL的溴乙锭；取DNA标准和原液样品，分别点样10μL进行电泳，电泳后置紫光灯观察和摄像。②紫外吸收波长扫描：取原液，用注射用水稀释10倍后于200～400nm进行紫外吸收波长扫描分析。

3.2 结果

经测定，DNA标准Ladder经254nm紫光灯观察显色，但样品无显色，表明样品中无双链DNA或RNA检出存在；样品经紫外扫描，最大紫外吸收波长为255.2nm，说明样品中含核苷酸类物质。综合此两个结果，样品中含有低分子量寡核苷酸。

4 多肽检测

分别用Lowry法[5]进行多肽含量测定和Tris-Tricine 凝胶电泳法[6]进行多肽分子量范围分析。

4.1 测定方法

4.1.1 Lowry法多肽含量测定

①BSA溶液的制备：精密称取BSA约10.0mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，精密量取1mL，置10mL量瓶中，加水至刻度，即为100μg/mL的BSA溶液，临用新制。②样品溶液：取原液用水稀释50倍即得。③测定法：取BSA溶液、水和样品溶液于10mL试管中，混匀，分别按测定试剂盒加入各试剂，混匀，室温放置30min后，照分光光度法测定650nm处吸光度。④结果计算：用BSA对照品溶液浓度对其相应吸光度作直线回归（R2≥0.99），由直线方程求出样品溶液多肽含量。

4.1.2 Tris-Tricine 电泳法多肽分子量测定

按Tris-Tricine电泳法，取原液样品进行电泳分析。上样量为20μL，恒压200V电泳。电泳结束后用考马斯亮蓝染色。

4.2 结果

结果显示，BSA溶液线形关系很好（图2），R2＞0.99。根据测定结果带入直线方程计算，供试品溶液中多肽含量为93.96μg/mL，供试品系样品稀释50倍所得，故样品中多肽含量为4.70mg/mL。同时Tris-Tricine电泳结果显示，样品在染色后凝胶上无显色条带，表明样品在Tris-Tricine电泳上无多肽检出。

图2 抗结核特异性转移因子原液多肽测定标准曲线和直线方程

5 抗结核特异性转移因子原液生物分子物质含量测定总结

本实验对抗结核特异性转移因子原液样品（批号2010060110）进行一系列生物分子物质含量测定，测定结果总结显示，该样品中未检测出脂类物质和双链核酸，明显检出糖类物质和多肽，其中糖类物质以核糖为主，因此可以推断本品主要物质为含单链寡核苷酸和低分子量多肽的混合物[7]。

[1]Mtithing J.High-resolution thin-layer chromatography of gangliosides[J].J Chromatography A,1996,720(1/2):3-25

[2]Reese ET,Mandels M.Methods in carbohydrate chemistry[M]//.Whistler RL,ed.New York: Academic Press,1963:139.

[3]Mejbaum WZ.Ober die Bestimmung kleiner Pentosenmengen,insbesonder in Derivaten der Adenylsaiire[J]Physiol Chem,1939,258(1):117.

[4]卢圣栋,现代分子生物学实验技术[M].2版.北京:中国协和医科大学出版社,1999.

[5]Lowry OH.Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent[J].J Biol.Chem,1951,193(1):265-275.

[6]Schagger H,Van Jagoe G.Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamine gel electrophoresis for separation of protein in the range from 1 to 100 kDa[J].Anal Biochem,1987,166(2):368-373.

[7]中国生物制品规程2000版[S].2000.