鹅不食草植物蛋白的纯化与含量测定

符玉荣

（吉林省长春中医药大学附属医院药剂科，吉林 长春 130021）

鹅不食草（Centipeda minima（L）A.Br.et Aschers）为菊科植物鹅不食草的干燥全草。据《本草纲目》记载有通窍，止咳之功。主治风寒感冒，咳嗽痰多，鼻塞不通，鼻渊流涕等。主要含有甾醇类、黄酮类、三萜皂苷、挥发油、胺类等成分。迄今为止，针对其蛋白类成分的研究还未见相关报道。蛋白质作为一类重要的大分子化合物，广泛存在于动物和植物的组织细胞中，是生命存在的主要物质基础。目前多集中于对动物蛋白的研究，对植物蛋白的研究相对较少，但研究发现许多植物蛋白具有较好的药理活性[1,2]，因此植物中蛋白质的相关研究应该引起广泛重视。本课题以鹅不食草为原料，对其蛋白类成分进行系统研究，为深入了解鹅不食草这一药用植物资源奠定基础。

1 材 料

1.1 仪器

UV-1700型分光光度计（日本岛津）；5424离心机（德国eppendorf）；PHS-4CT酸度计（上海紧密仪器仪表有限公司）；EPS-200电泳仪（上海天能科技有限公司）；Bench-top冻干机（美国Millrock）；MDCC-14透析袋（上海基峰）。

表1 SP柱层析各洗脱成分总蛋白的含量

1.2 试药

鹅不食草（采于吉林长白县）；低分子质量标准蛋白（上海基峰，批号674501351）；牛血清白蛋白标准品（上海基峰，批号796502312）；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 硫酸铵沉降法提取鹅不食草粗蛋白

取鹅不食草粉末适量，用8倍量Tris-HCl（25mmol/L，pH值7.0）超声提取2h，过滤，药渣加6倍量Tris-HCl（25mmol/L，pH值7.0）超声提取1h，过滤，合并两次滤液，滤液中加固体硫酸铵至饱和度80%，静止后于-20℃条件下加入80%丙酮，离心后取沉淀，-20℃挥净丙酮，Tris-HCl（25mmol/L，pH值7.0）溶解沉淀，过滤后所得续滤液即为粗蛋白提取液。

2.2 鹅不食草粗蛋白提取物的纯化

2.2.1 样品透析

将粗蛋白提取液在4℃条件下用Tris-HCl缓冲溶液（25mmol/L，pH值7.0）透析24h（每间隔12h更换一次缓冲溶液），得透析液。

2.2.2 样品脱色

取透析液，加入活性炭（10mL：0.3g）搅拌脱色10min，静止、过滤，滤液冻干后得脱掉植物色素的蛋白粗提物。

2.2.3 样品纯化

取粗蛋白冻干品少量，Tris-HCl（50mmol/L，pH值7.0）溶解后上G100，根据紫外检测器（检测波长280nm）检测结果富集流出液，流出液上DEAE Sepharose（柱高2cm，柱床体积为5mL），DEAE Sepharose流穿上SP Sepharose（柱高2cm，柱床体积为5mL），SP Sepharose层析柱用0.5mol/L NaCl（NaCl用25mmol/L、pH值为6.0的Tris-HCl缓冲溶液溶解）溶液洗脱，流速0.5mL/min，检测器波长280nm，按管收集，所得洗脱液用Tris-HCl缓冲溶液（25mmol/L，pH值7.0）透析24h，透析液冻干，即得鹅不食草纯化蛋白。

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备

2.3.1 缓冲液的制备

取Tris0.3g，甘油2.5mL，β-巯基乙醇2.5mL，溴酚蓝0.025g，SDS0.5g，溶于25mL蒸馏水中，HCl调pH至7.0即得。

2.3.2 蛋白质样品的制备

取纯化蛋白冻干样品，溶于2.3.1项下制得的缓冲液中，使浓度为1mg/mL，取20μL溶液沸水浴中加热5min，冷却离心后即得。

2.3.3 低分子质量标准蛋白溶液的制备

取低分子质量标准蛋白，溶于2.3.1项下制得的缓冲液中，使浓度为2mg/mL，取20μL溶液沸水浴中加热5min，冷却后即得。

2.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶按Laemmli法[3]进行，凝胶浓度为15%。蛋白鉴定结果，如图1。

2.4 Lowry法测蛋白含量[4]

2.4.1 蛋白样品的制备

精确称取SP Sepharose纯化蛋白冻干样0.1g， 置100mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至刻度，作为供试品溶液。

2.4.2 白蛋白标准溶液的制备

图1 鹅不食草蛋白SP柱层析各洗脱成分电泳图

精确称取牛血清白蛋白30mg， 置100mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至刻度，作为蛋白质标准储备液。

2.4.3 显色剂的制备

配置4%碳酸钠50mL，2%氢氧化钠50mL，1%硫酸铜10mL，2%酒石酸钾钠10mL。将以上四种溶液混匀得试剂甲。Folin--酚试剂为试剂乙。

2.4.4 标准曲线的绘制

分别精确量取白蛋白标准溶液（304μg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中，定容至1mL，加试剂甲5mL，混匀，室温放置10min，快速加入试剂乙0.5mL，混匀，室温放置1h，以第1管为空白，采用分光光度法于500nm处测定其吸光度。以蛋白质含量（m）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标进行相关分析，得出回归方程为：A=0.0016m+0.023，r=0.9992。结果表明溶液浓度在60.8～304μg/mL范围内，吸光度与浓度呈良好线性关系。

2.4.5 蛋白含量的测定

量取上述蛋白样品溶液1mL，按标准曲线的绘制项下方法进行含量测定，自“加试剂甲5mL”起, 依法测定其吸光度，用直线回归法计算蛋白含量。蛋白含量，见下表1。

3 讨 论

鹅不食草蛋白是典型的植物蛋白，植物色素含量多，成分复杂，在原植物中的含量少。但本实验通过提取、分离、纯化等过程，大大提高了其纯度，使最终蛋白含量达到85%以上，并有效脱掉其所含植物色素。值得一提的是，本实验用活性炭脱鹅不食草中的植物色素效果明显，且不吸附蛋白，用量少，节省时间，相对PVP法、C18法大大节省成本。

在纯化过程中发现，鹅不食草蛋白经过DEAE Sepharose层析柱后大量蛋白没有被吸附，而是存在于流穿当中，流穿经过SP Sepharose后明显被吸附，说明鹅不食草植物蛋白中碱性蛋白居多。

通过凝胶电泳结果显示，鹅不食草蛋白相对分子质量在18 100与92 000区间，约有5种主要蛋白带，且电泳条带较窄，数目多，清晰，且在20 100、43 000、66 200KD处有三条主蛋白带。电泳结果进一步验证提取纯化方法的有效性。为进一步分离纯化鹅不食草植物蛋白奠定基础。

Lowry法是生物化学领域测定微量蛋白质用得最多的方法，其精密度好，对多个样品同时测定较为方便。故本实验采用Lowry法测定鹅不食草植物蛋白安全可靠。

[1]中国生物制品标准化委员会编.中国生物制品规程[S].北京:化学工业出版社,2000,671-672.

[2]李晓波,金鑫,李妍等.植物类中药活性蛋白成分研究进展[J].中草药,2004,35(6):706-708

[3]哈密斯BD,利克伍德D. 蛋白质的凝胶电泳方法[M]. 北京: 科学出版社, 1994 : 19221.

[4]史锋.生物化学实验.杭州:浙江大学出版社,2002.