DNA甲基化转移酶1在非小细胞肺癌中的

表达及临床意义

刘启明

(江苏省睢宁县人民医院呼吸内科,江苏徐州,221200)

近10年来,肺癌的发病率和死亡率一直位居各种恶性肿瘤首位。肺癌的发生也是多因素作用、多基因参与、经过多个阶段才最终形成的极其复杂的生物学特征。DNA甲基转移酶 1(DNMT1)是细胞生命所必需的蛋白,其催化的甲基化修饰在调控细胞正常生长中有重要作用。DNA的甲基化有其重要的生物学意义,它在控制基因的表达、维持染色体的完整性和调节DNA的重组等方面都有重要的作用[1]。DNMT1在肺癌组织中表达以及与肿瘤的分期、分化程度、年龄、性别、吸烟等临床特征的关系,目前国内外研究的较少。本实验采用免疫组织化学技术检测非小细胞肺癌组织中和DNMT1蛋白表达情况,并探讨表达与患者临床特征的关系。为探讨DNMT1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的发病机制、病理诊断、预后价值以及为选择治疗的靶点提供一定的理论和实验依据。现报告如下。

图1 病理分型

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院胸外科2005年3月～2008年10月手术切除的NSCLC(术前均未行化疗和放疗)标本54例。其中男33例、女21例,<60岁者28例;≥60岁者26例;有长期吸烟史22例,无吸烟史32例;鳞癌 25例,腺癌 29例,见图 1;高分化11例,中分化 31例,低分化12例;Ⅰ期 22例,Ⅱ期10例,Ⅲ～Ⅳ期22例(根据术后病理,依据1997国际抗癌联盟制定的肺癌TNM分期标准进行分期)。并分别取癌旁组织(在癌灶周边5 cm内的肺组织)48例及周围正常肺组织(远离癌灶5 cm以上,且镜检无癌细胞)24例。所有组织标本使用中性甲醛固定,石蜡包埋备用。

1.2 方法

组织学染色:肺组织病理标本使用中性甲醛固定,石蜡包埋,5 μ m连续切片,常规 HE染色。测定程序性细胞死亡4(PDCD4)和DNMT1的免疫组织化学染色:①石蜡切片置于60℃烤箱中烤片2 h,常规脱蜡入水;蒸馏水冲洗1次;②0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0即配即用)微波炉抗原修复,加热至沸腾,自然冷却;③0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3 min×3次;④3%过氧化氢室温孵育10 min,以阻断内源性过氧化物酶;⑤0.01M PBS冲洗3 min×3次;⑥滴加兔抗人PDCD4、DNMT1及PBS空白对照,于4℃过夜;⑦DAB显色试剂盒显色,室温2 min,显微镜下控制反应时间,蒸馏水冲洗终止反应;⑧苏木素轻度复染细胞核;⑨中性树封片,显微镜下观察免疫反应阳性结构的着色、分布情况。

1.3 实验结果判定

每例标本均用PBS代替一抗作阴性对照,以已知阳性片作为阳性对照。细胞质内出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性染色。参考Monica等的半定量计数方法,根据肿瘤组织细胞的染色率和染色强度进行判定。在400倍镜下选取5个视野,计数至少500个肿瘤细胞中DNMT1蛋白阳性表达细胞所占百分率。肿瘤细胞阳性率<5%为0分,5%≤肿瘤细胞阳性率<25%为1分,25%≤肿瘤细胞阳性率<50%为2分,50%≤肿瘤细胞阳性率<75%为3分,≥75%为4分;根据染色强度分为 3类,弱为 1分,中等为 2分,强为3分。每个视野阳性细胞率与染色强度得分相乘为每个视野得分,最终得分为5个视野的平均值。规定0～4分为阴性,5～8分为阳性表达,9～12分为高表达。

2 结果

2.1 DNMT1的表达

DNMT1在 NSCLC组织、癌旁组织、正常肺组织中表达阳性率分别为39/54(72.2%)、30/48(62.5%)、0/24(0%),癌及癌旁组织与正常组织表达之间的均有统计学意义(P<0.01)。癌及癌旁出现高表达(见表1,图2)。

表1 DNMT 1在肺癌组织、癌旁及正常组织中的表达(例)

2.2 DNMT1在肺癌组织中表达与TNM分期的关系

TNMⅠ期DNMT1在肺癌组织中表达阳性率为72.7%(16/22),DNMT1在Ⅱ期肺癌中阳性率为80.0%(8/10),DNMT1在Ⅲ～Ⅳ期肺癌中阳性率为68.2%(15/22)。各组之间差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 DNMT1在肺癌组织中表达与TNM分期、NSCLC组织分化程度、患者临床病理特征的关系(例)

图2 不同组织DNMT1的表达

2.3 DNMT1的表达与肺癌组织分化程度关系

DNMT1的表达与肺癌组织分化程度无关,差异无统计学意义(P<0.05),见表2。

2.4 DNMT1表达与患者临床病理特征的关系

DNMT1的表达与 NSCLC患者的性别、年龄、吸烟史、病理类型等临床特征差别均无统计学意义(P>0.05),见表2。

3 讨 论

DNA的甲基化是由DNA甲基化转移酶家族DNMTs(DNA C5胞嘧啶甲基转移酶)介导,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基化供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(5mC)的一种反应。DNA的甲基化有其重要的生物学意义,它在控制基因的表达,维持染色体的完整性和调节DNA的重组等方面都有重要的作用。许多研究表明,很多肿瘤的发生都与相关抑癌基因启动子区域CpG岛的甲基化有关[2-3]。这种基因与细胞周期、DNA的修复、分化、凋亡、肿瘤转移和血管的形成等密切相关。

Bestor等[4]于1988年克隆了第一个真核生物C5胞嘧啶甲基化转移酶1-DNMT1,该基因编码含1620个氨基酸残基的蛋白质,分子量为190 kD。DNMT1主要作用是在每次DNA复制后的修饰过程中,对新合成的DNA链进行甲基化。

多种癌组织中一些肿瘤的相关基因如p73、p16 、E-cadherin 、SOCS-1 、RUNX-3 、cyclinD2 、CDH1、RAR-β等存在启动子区域CpG岛的甲基化,这些基因具有负调控细胞周期、错配修复、血管生成抑制、细胞黏附等功能,此种修饰可使该基因在癌组织中沉默,致使肿瘤的发生。

国内顾立萍等[5]利用免疫组化SP法研究了DNMT1在胃癌中的表达情况,结果表明与正常的胃粘膜组织相比,在胃癌组织中,DNA甲基化修饰率有可能显著提高。吴振启等[6]检测结果发现膀胱癌组织中DNMT1阳性表达率明显高于正常组织,说明DNMT1高表达可能与膀胱癌的发生发展有关。翟荣林等[7]发现结肠表观遗传调节是通过甲基化活性增强而不是去甲基化活性减弱实现的。用RT-PCR法研究DNMTs在正常血细胞和急慢性髓细胞性白血病中mRNA的表达时发现,DNMT1急性髓细胞性白血病和慢性髓细胞性白血病的急性期mRNA的表达比正常骨髓细胞分别增高5.3和2.3倍。Park HJ[8]用RT-PCR法测得DNMT1 mRNA在肝癌和正常肝组织中的表达分别为33.3%和40.7%,同时抑癌基因也存在着甲基化现象。杨希等[9]采用免疫组化法检测95例肺腺癌和癌旁正常组织中的DNMT1的蛋白表达情况,结果48例患者癌组织呈阳性表达,而癌旁正常组织全部呈阴性表达。亚组分析显示DNMT1的蛋白阳性表达与性别显著相关(P=0.018),女性肺腺癌表达明显增高,表明DNMT1表达增高可能与体内的雌激素水平有关。通过 Kaplan-meier法和 Log-Rank法分析显示,DNMT1的蛋白阳性表达是肺腺癌患者预后差的标志。Kwon YM[10]研究显示吸烟>65包/年的肺癌患者DNMT1 mRNA表达是吸烟<45包/年肺癌患者的 4.17倍。提示DNMT1阳性表达增高与吸烟的量有关。以上资料证明DNMT1在许多实体瘤和造血系统的肿瘤中表达均明显升高。

本组实验结果发现 DNMT1在 NSCLC组织、癌旁、周边正常组织中表达阳性率分别为39/54(72.2%)、30/48(62.5%)、0/24(0%), 癌、癌旁组织与正常组织表达之间的差异有统计学意义(P<0.01)。表明DNMT1在肺癌组织中呈现高表达,在正常肺组织中表达为阴性,与杨希等[9]研究结果一致。提示DNMT1可以作为非小细胞肺癌病理诊断的标志物。本组资料显示DNMT1在肺癌组织中的表达与TNM分期、细胞分化程度、患者年龄、吸烟史均无相关性。在吸烟和不吸烟的癌组织中表达相近,与杨希等[9]研究资料相同。而与Kwon YM[10]研究在吸烟>65包/年和<45包/年肺癌患者中表达存在着差异不同。在Ⅰ期和Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期之间差异均无统计学意义(P>0.05)。提示DNMT1与NSCLC的预后相关性较差。女性、腺癌DNMT1的表达略高于男性、鳞癌,但统计学无差异(P>0.05),与杨希等[9]研究在女性腺癌中表达较高,相对男性对照组有统计学差异不同。是否与样本量过少有关,有待进一步研究。

本研究发现:①DNMT1在NSCLC癌组织、癌旁组织中出现高表达,在正常肺组织中表达缺失,提示DNMT1参与NSCLC发病机制,可以作为病理诊断NSCLC的标志物。②DNMT1与非小细胞肺癌的分化程度、TNM分期、患者的发病年龄、性别、吸烟史、组织学类型均无显著性差异。不能作为临床预后指标。

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