阳离子脂质/DNA复合物气雾剂的制备及其体外细胞转染研究

盛芝娜，潘怡娜，魏晓慧，徐宇虹（上海交通大学药学院，上海市200240）

基因治疗（Gene therapy）和基因输送（Gene delivery）是20世纪的新兴研究领域，自1992年Stribling等[1]首次证明呼吸道基因给药的可行性以来，已经被逐渐应用于多种呼吸道局部及全身性疾病的治疗中，如肺部囊性纤维化、肺癌、哮喘等[2～4]。已报道[5]的基因呼吸道给药方式主要有滴鼻给药、气道插管给药、雾化吸入给药等，但适用于耐压定量气雾（pMDI）装置的基因给药制剂还未见文献报道。pMDI是吸入给药装置的一种，要求将药物与适宜的抛射剂混合装于具有特制阀门系统的耐压容器中，使用时借助抛射剂的压力将内容物呈雾状喷出，患者配合呼吸主动吸入。pMDI气雾剂的主要特点是在呼吸道分布广泛且均匀，给药剂量准确，同时携带、使用也很方便。

制备适用于pMDI装置的基因给药制剂所面临的最大挑战是：常用的基因载体都是水溶性，无法与抛射剂、助溶剂互溶灌装成气雾剂使用，因此研制出疏水性的基因载体是当务之急。本文根据Bligh and Dyer萃取原理[6]，改良后发展了一种新的阳离子脂质/DNA复合物的制备方法，对制得的载体系统进行了表征，并初步评价了灌装后的气雾剂的毒性及细胞转染效率。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Laborota 4000旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；Zetasizer Nano ZS90激光粒度分布仪（英国Malvern公司）；UV-21.2PC紫外分光光度计（美国Unico公司）；多功能酶标仪（美国Bio-Rad公司）；单管式化学发光分析仪（德国Berthold公司）；BCM-100生物洁净工作台（苏州净化设备有限公司）；气雾罐、定量阀及触动器（苏州万通Aptar定量阀系统有限公司）；气雾灌装机（上海华新气雾剂有限公司）。

1.2 试药

阳离子脂质 DOTAP（1，2-dioleoyl-3-trimethyl-ammonium-propane，美国Sigma公司，批号：086K5200，纯度：＞99%）；荧光素酶质粒pGL3-Control、荧光素酶检测底物及细胞裂解液（美国Promega公司）；氟利昂F12（瑞丽气体有限公司）；RPM I 1640培养基、胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司）；MTT（北京博大泰克生物基因技术有限责任公司）；三氯甲烷、甲醇、异丙醇、无水乙醚、二甲亚砜等试剂均为分析纯。

1.3 细胞模型

人肺腺癌细胞H1299（贴壁生长）由中国科学研究院上海细胞所提供。细胞在含10%胎牛血清的RPM I1640培养基中于37℃、5%CO2的细胞培养箱内连续培养。试验细胞取处于对数生长期的细胞进行。

2 方法与结果

2.1 阳离子脂质/DNA复合物及其气雾剂的制备

Bligh and Dyer萃取法[6]是将氯仿、甲醇、水以一定比例混合得到单相体系的过程，Reimer等[7]已应用该法制备得到疏水性的阳离子脂质/DNA的复合物。据此，笔者对该法进一步优化，发现当以氯仿-异丙醇-水替代氯仿-甲醇-水形成单相体系制备阳离子脂质/DNA复合物时，既可以获得适宜大小的粒子，又可以显著提高质粒DNA的包封率。

取0.5mg pGL3-Control溶解于水中，按氮-磷比（N/P ratio）＝1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1分别取DOTAP适量溶于氯仿，将氯仿-异丙醇-水以体积比1∶2.6∶1混合。混合单相在室温下充分反应30m in后，再加入等量的氯仿和水，于4℃、相对离心力2 700 g条件下离心7m in分层。分离下层相，旋蒸除去有机溶剂后再用2m L无水乙醚溶解；将该溶液转移到气雾瓶中，选用50μL的定量阀，用气雾灌装机封口后灌入一定量的抛射剂氟利昂（制剂溶液∶抛射剂＝1∶6，质量比）[8]制得气雾剂。气雾剂可以在室温下保存，使用前倒置一夜以保证每喷定量。

2.2 DOTAP/DNA复合物的表征

用定磷法[9]测定制备的有机相中DNA的含量，按公式：载药率＝有机相中DNA含量/投药量×100%，计算DOTAP/DNA复合物装载DNA的效率。用激光粒度分布仪测定制备所得的DOTAP/DNA复合物在乙醚溶剂中的粒径，以及气雾剂喷出后在水相中收集到的复合物的粒径。所有数据为连续制备的3批制剂的参数测定平均值，详见表1。

表1 不同N/P比的DOTAP/DNA复合物的表征参数（ ±s，n＝3）Tab 1 Characterization parameters of DOTAP/DNA comp lexesw ith different N/P ratios（ ±s，n＝3）

表1 不同N/P比的DOTAP/DNA复合物的表征参数（ ±s，n＝3）Tab 1 Characterization parameters of DOTAP/DNA comp lexesw ith different N/P ratios（ ±s，n＝3）

表征参数气雾剂水相收集液中平均粒径/nm 639.400±85.657 245.200±58.830 397.500±139.400 714.900±56.510 1 966±708 N/P比1∶1 2∶1 4∶1 8∶1 16∶1 DOTAP/mg 1.040 2.080 4.160 8.320 16.640载药率/%37.400±0.900 72±1.580 67.400±1.720 57.100±1.321 45±1.208乙醚溶剂中平均粒径/nm 484.800±91.060 188.700±42.770 263.400±59.610 563.100±128.230 1 673±356.112

由表1可见，当阳离子脂质DOTAP和DNA以N/P比2∶1和4∶1混合制备时，得到的DOTAP/DNA复合物及其气雾剂具有较高的载药率，且粒径分布较稳定均一。

2.3 气雾剂的细胞毒性试验

由于气雾剂中所含的乙醚等溶剂本身具有一定的细胞毒性，所以通过预试验考察权衡了溶剂毒性与转染效率的关系，最终选择了毒性较低且能保证转染效率检测的每孔4μg DNA（6孔板）的投药量，来评价气雾剂的细胞毒性大小。用经典的MTT法测定：将不含DOTAP/DNA复合物，即仅罐装等量无水乙醚的空白气雾剂作为阴性对照组，N/P比为2∶1、4∶1的气雾剂为试验组；H1299以2×104个/m L的细胞浓度、每孔2m L加入6孔板中，置于37℃、5%CO2饱和湿度下培养24 h，移除培养基，每孔喷入气雾剂各6喷（每喷含有0.667μg DNA量），每个浓度设3个平行复孔；孵育4 h后，置换为1.5m L新鲜的完全培养基，24 h后，每孔加入5mg·m L－1的MTT 150 μL，继续培养4 h后，再加入二甲亚砜1.5m L，溶解沉淀。用酶联免疫检测仪在490、650 nm波长条件下分别测定每孔的光密度（OD），其中490 nm为检测波长，650 nm为参比波长。以滴加磷酸盐缓冲溶液（PBS）的细胞作为空白对照（100%），按以下公式计算各组细胞的相对存活率：细胞相对存活率＝（试验组OD490nm－试验组OD650nm）/（空白对照组OD490nm－空白对照组OD650nm）×100%，结果如图1所示。

图1 各组细胞相对存活率结果（n＝3）Fig 1 Relative cellsurvival rate of each group（n＝3）

由图1可知，阴性对照组即空白气雾剂的毒性主要是由气雾喷力及有机试剂导致的，但基本可以保证细胞（95.600±7.300）%的存活率；N/P比为2∶1和4∶1时DOTAP/DNA复合物气雾剂分别可以维持（91.643±6.970）%和（87.630±7.643）%的存活率。其细胞毒性相对于阴性对照来说差异并不显著，可见制剂本身导致的毒性比较小。

2.4 DOTAP/DNA气雾剂的细胞转染效率研究

H1299细胞以2×104个/m L的密度、每孔2m L传入6孔板上，培养24 h。将裸DNA（pGL3-Control）溶液直接滴加至细胞板孔内作为对照组，N/P比2∶1、4∶1的气雾剂为试验组，以每孔6喷的剂量喷入。孵育4 h后置换新鲜培养基，同条件下继续培养24 h后，检测荧光素酶活性，以每1mg细胞蛋白的相对光单位（RLU·mg－1）来表示转染效率的强度。RLU·mg－1值越高，转染效率则越高，试验结果见图2。

图2 各组荧光强度结果与其他2组比较：＊P＜0.05Fig 2 Resultsof fluorescence intensity in each group vs.other2 groups：＊P＜0.05

图2 结果表明，相比于裸DNA组和N/P比为4∶1的气雾剂组，N/P比为2∶1的气雾剂组的荧光强度最高，即其转基因表达效率最高，具有较好的基因转染活性（P＜0.05）。

3 讨论

呼吸道基因输送系统在近20年得到不断的发展并具有广阔的应用前景。吸入给药是呼吸道给药的主要方式之一，其相比滴鼻给药能够更有效地分布至下呼吸道，同时又可以避免气道插管法的强侵入性[10，11]。目前吸入制剂有气雾剂、雾化剂、喷雾剂和粉雾剂4种，气雾剂具有易携带、易使用、呼吸道分布广泛均匀等特点，但是在呼吸道基因输送方面还没得到应有的应用和重视，这主要与基因载体水溶性的物化性质有关。本研究采用温和的制备方法——改良的Bligh and Dyer萃取法，制得可以分散于有机溶剂的DOTAP/DNA复合物，并与氟利昂灌装得pMDI气雾剂，为pMDI应用到呼吸道基因输送系统的研究增添了新的方向和技术。

本文制备了一系列不同N/P比的DOTAP/DNA复合物，测定发现最高的DNA装载效率约为（72±1.580）%，其粒径大小为（188.700±42.770）nm；又进一步在细胞试验中考察了几种不同N/P比的气雾剂的毒性和基因转染效率。结果表明，N/P比为2∶1的气雾剂能够有效地介导DNA对肺癌细胞的基因转染。这为该气雾剂下一步的体内研究提供了依据，可在呼吸道局部及全身性疾病的基因治疗方面进行尝试，如肺部囊性纤维化、肺癌、哮喘及疫苗等。

综上所述，本试验采用改良的Bligh and Dyer萃取法，制得了大小均一、DNA装载效率较高的DOTAP/DNA复合物及气雾剂。体外研究试验表明，其细胞相对存活率分别维持在（91.643±6.970）%和（87.630±7.643）%，细胞毒性较低，同时可以显著提高细胞蛋白转染效率，预示着该pMDI气雾剂作为呼吸道基因输送系统的潜力和可行性。

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