兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究

张开刚，张月东，王 玫

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来发现的一种成体干细胞，2001年Zuk等[1]首次从人的脂肪组织悬液中分离出类似于骨髓间充质干细胞，可以在体外稳定增殖，具有多向分化潜能的脂肪干细胞。因具有来源丰富、取材方便、对机体的损伤小、增殖快、能多向分化等优点，迅速成为组织工程学、再生医学等领域的研究热点。本实验通过分离培养兔脂肪干细胞，研究其成骨分化能力，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠（sigma公司，美国）；高糖DMEM（Gibco公司，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染 色 试 剂 盒 、EDTA、四环素（华美生物工程公司）；茜素红（Amersco公司，美国）；恒温CO2培养箱（Queue Systems公司，美国）；病理切片机（leica公司，德国）。

1.1.2 实验动物 4月龄体重为2.0～2.5 kg的健康新西兰大白兔，雌雄不拘，泰山医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）2005-0005。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分离、培养及传代 4月龄健康新西兰大白兔，经耳缘静脉注射空气栓塞致死，取兔双侧腹股沟脂肪，PBS液冲洗剪碎，Ⅰ型胶原酶法消化，加入高糖DMEM培养液重悬浮，恒温CO2培养箱内培养，隔日换液，融合达90%～95%后倾倒原培养液，PBS液轻缓漂洗贴壁细胞2次，尽量洗去残余血清，弃PBS液。在培养瓶中加入适量消化液（0.20%胰蛋白酶+0.02%EDTA）消化，吸管吸取培养液，反复轻柔吹打培养瓶底壁，使已消化的细胞脱离瓶壁，吹打液1200 r/min离心10 min，弃上清。用培养液将沉积细胞重新悬浮，接种于25 cm2培养瓶中，传代比例为1∶2，倒置相差显微镜下观察细胞形态特征及传代情况。

1.2.2 ADSCs的成骨诱导培养 成骨诱导培养液的配制按文献[2]所述：DMEM培养液+10%胎牛血清+0.l μmo1/L地塞米松+50 mg/L维生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+1%双抗（青霉素、链霉素）；普通培养液的配制：高糖DMEM培养液+10%胎牛血清+1%双抗（青霉素、链霉素）

取第3代ADSCs，以l×105/cm密度接种于24块盖玻片，置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱内培养。待细胞长满后随机分为2组，其中12片作为成骨诱导组，加入成骨诱导液复合培养，进行成骨诱导分化；其余12块作为对照组，加入普通培养液培养。共培养4周，每72 h换液1次。

1.2.3 ADSCs的鉴定 以下3种染色实验均重复进行3次。

ALP染色：第3代细胞成骨诱导1周后取出盖玻片，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，滴加ALP染色液，蒸馏水反复冲洗3次，晾干后甘油明胶封片、镜检。

茜素红染色：第3代细胞成骨诱导4周后取出盖玻片，洗涤3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，加入1%茜素红溶液（pH 8.3，Tris-HCl配制），37℃染色30 min，蒸馏水反复冲洗3次，晾干后甘油明胶封片、镜检。

Von Kossa（钙结节）染色：第3代细胞成骨诱导4周后取出盖玻片，洗涤3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，加入5%硝酸银溶液，避光孵育30 min，紫外线灯下染色1 h，蒸馏水冲洗3次，加入5%硫代硫酸钠作用5 min，蒸馏水冲洗3次，1%中性红复染5 min，蒸馏水反复冲洗3次，晾干后甘油明胶封片、镜检。

2 结果

2.1 ADSCs体外培养的生物学特性

原代ADSCs 8 h开始贴壁，24 h完成贴壁，接种后可见部分悬浮呈圆形的血细胞混杂其中，轮廓清晰，细胞呈短梭形和多角形（图l），5～7 d融合达90%～95%，大约两周内传至第3代，细胞数量扩增200～300倍，绝大多数细胞呈扁平的长梭形，局部排列有一定方向性，呈鱼群状（图2）。

2.2 ADSCs体外成骨诱导及鉴定

2.2.1 ALP染色 培养第3代的ADSCs细胞成骨诱导1周之后进行ALP染色，胞浆内可见蓝色颗粒（图3），而对照组ALP染色呈阴性（图4）。

2.2.2 茜素红染色 培养第3代的ADSCs细胞成骨诱导4周之后进行茜素红染色，细胞结节中央染色为红色团块，细胞结构为紫红色（图5），对组照仅见紫色细胞结构，结节中央未见红色团块染色（图6）。

图1 原代ADSCs呈短梭形（×100）

图2 第3代ADSCs呈扁平长梭形，形成鱼群状（×100）

图3 ALP检测胞浆内可见蓝色颗粒（ALP染色，×200）

图4 对照组ALP染色阴性（ALP染色，×200）

2.2.3 Von Kossa染色 培养第3代的ADSCs细胞成骨诱导4周后行Von Kossa染色，细胞集落中央区形成明显的钙化结节，细胞结节中央为黑色团块（图7），对照组则无黑色团块形成（图8）。

3 讨论

干细胞是一种具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞，是构建组织工程骨重要的种子细胞来源。根据来源不同，干细胞可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（adult stem cell，ASC）。ASC存在于人体各种组织中，具有自我更新和分化成多种组织（骨、软骨、脂肪、神经）的能力，正常生理情况下干细胞多处于G0期或缓慢向G1期转化[3]。在研究领域，许多人和动物不同部位来源的ASC已得到分离和鉴定[4-6]。脂肪干细胞（ADSCs）是近年来发现的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞类似，有多向分化潜能，可以在体外稳定增殖。因其具有安全性高[7]、获得率高等优点，故迅速成为目前组织工程学的研究热点。有文献指出，ADSCs接种12～24 h后细胞可达到完全贴壁，传代培养后增殖迅速，能稳定传代10代左右，故此可为组织修复提供充足的种子细胞[8-9]。亦有研究证实，ADSCs成骨培养后，细胞外基质中出现Ⅰ型胶原蛋白、BMP-2、BMP受体等[10-11]成骨基因表达产物。本实验对兔皮下脂肪进行分离培养，结果显示，兔ADSCs贴壁迅速，细胞呈短梭形和多角形，传代后细胞增殖迅速，具有成骨分化潜能。

研究显示，ADSCs的体外分离及培养所应用的消化酶、消化方法并不完全相同[12-13]，由于成熟脂肪基质中含有大量Ⅰ型胶原，因此本实验采用Ⅰ型胶原酶消化法分离ADSCs，用培养基重悬细胞后接种到培养瓶中，通过细胞贴壁获得ADSCs。

关于ADSCs的鉴定，目前尚未发现特异性表面分子标志物。本实验通过观察细胞的形态并绘制生长曲线，发现此细胞具有稳定、迅速的增殖能力，符合干细胞的生物学特点；而在脂肪干细胞分离、纯化过程中的一些混杂细胞如红细胞、内皮细胞、成纤维细胞等，尽管很难一次性彻底清除，但数量很少，约占细胞群的5%～20%，这些细胞大部分不能贴壁生长，增殖能力有限，随传代培养其数量逐渐减少。需要强调的是，在ADSCs运用过程中，选择合适时机、提高纯度是首要问题。本实验选择在倒置相差显微镜下观察判断：一般以细胞突起回缩、细胞间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，此时应立即吸出消化液，加入含有血清的培养液，终止消化，以保证消化的纯度。

本研究通过反复3次试验证实，第3代ADSCs在成骨诱导培养下，1周时通过ALP染色检测，胞浆内可见蓝色颗粒，表明细胞在诱导1周时已具有成熟成骨细胞的特点；4周时茜素红染色检测，细胞结节中央染色为红色团块，细胞结构为紫红色，显示细胞已形成钙盐沉积，进入矿化期；4周时钙结节染色检测，细胞集落中央区形成明显的钙化结节，大量钙盐沉积，表明细胞进入基质矿化期。而对照组培养的细胞均无相应变化。

本实验虽在体外提取出兔脂肪干细胞并进行成骨诱导培养，但对于脂肪干细胞的鉴定未进行更明确的指标测定。下一步研究希望能够利用脂肪干细胞与支架材料复合，构建新型仿生性材料，并进一步开展其在修复骨质缺损方面的动物实验研究。

图5 细胞结节中央为红色团块（茜素红染色，×40）

图6 对照组细胞结节中央未见红色团块（茜素红染色，×40）

图7 细胞结节中央为黑色团块（Von Kossa染色，×40）

图8 对照组细胞结节中央无黑色团块（Von Kossa染色，×40）

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