细胞内外钙在川芎嗪舒张豚鼠气管平滑肌中的作用

许小洋 许继德 刘筱蔼

（广州医学院基础学院生理教研室，广东 广州 510182）

在哮喘的治疗中，抑制气道平滑肌的痉挛仍然是急性期治疗的关键[1]。近年来发现中药川芎的提取物川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）具有心血管保护作用[2,3]，同时还发现川芎嗪具有一定的抑制气管平滑肌痉挛及增殖的效应[4,5]。然而，目前对川芎嗪舒张支气管效应的详细机制尚不明确。各种致痉物质最终作用于气道平滑肌中由钙离子介导的兴奋－收缩耦联机制，从而使气道平滑肌产生痉挛。而气道平滑肌细胞浆中的钙来源于胞外钙内流或肌质网的钙释放，川芎嗪有可能就是通过影响钙的这两种来源进而产生其效应的。为此，本实验利用离体灌流的方法，探讨川芎嗪舒张气道平滑肌的效应与细胞内外钙离子的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与试剂

Hartley豚鼠（中山大学实验动物中心）；川芎嗪（TMP，美国Sigma公司）；EGTA 和thap sigargin（TSG，美国Sigma公司）；盐酸异丙肾上腺素（上海禾丰制药有限公司，批号：090703）；Krebs-Henseleit 营养液（K-H液）组成如下（mmol/L）：NaCl 120，KCl 4.5，CaCl22.5，NaHCO325，KH2PO41.2，MgSO4·7H2O 0.8，葡萄糖10.1；无钙K-H液中去除CaCl2，加入0.1mmol/L EGTA。

1.1.2 仪器

HSS-1数字式超级恒温浴槽（成都仪器厂），BL-420E生物信号采集处理系统（成都泰盟）。

1.2 实验方法

1.2.1 豚鼠离体气管环制备

健康豚鼠，雌雄不拘，200～250g，击昏豚鼠，动脉放血致死，立即取出气管，置K-H液中，制备成气管螺旋条（含3个软骨环）。将标本置37℃ K-H 液水浴槽内，通氧气，将气管平滑肌环静息张力调至1.5g力（15.7×10-3N）。张力通过张力换能器输入BL-420E生物信号采集处理系统记录。气管平滑肌标本在浴槽内稳定1h 后开始实验。

1.2.2 实验分组

TMP对离体豚鼠气管平滑肌环的效应观察分两组：TMP组和空白组。TMP组分别加入10-6～10-3mol/L TMP，待其基线平稳后再加入10-6mol/L的异丙肾上腺素，以异丙肾上腺素的舒张度为100%计算各浓度TMP的舒张率。空白组则加入等量的K-H 液作为对照。

细胞内外钙在TMP舒张气管平滑肌中的作用观察分有钙K-H 液组和无钙K-H 液组2大组。有钙K-H 液组的实验均在有钙K-H 液中进行，又分为有钙＋TMP组和有钙＋TSG＋TMP组：前组只加入10-3mol/L TMP，后组预先加入TSG（10mmol/L）40min，再加入10-3mol/L TMP。无钙K-H 液组的实验均在无钙K-H 液中进行，又分为无钙＋TMP组和无钙＋TSG＋TMP组：前组只加入10-3mol/L TMP，后组预先加入TSG（10mmol/L）40min，再加入10-3mol/L TMP。分别记录静息张力及给药后的张力，并计算张力变化值（即差值），差值＝静息张力－给药后张力。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0对实验数据进行统计处理。数据以均数±标准差（±s）表示，数据的显著性比较选用组内成对数据t检验或组间独立样本t检验。P＜0.05被认为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 TMP对离体豚鼠气管平滑肌的舒张作用

与空白组对照，TMP对离体豚鼠气道平滑肌具有明显的舒张作用（P＜0.01），并且呈剂量依赖性（10-6～10-3mol/L），在10-3mol/L浓度时，其舒张率与异丙肾上腺素基本相等（图1）。

2.2 细胞外钙在川芎嗪舒张效应中的作用

结果见表1。在有钙K-H液中，川芎嗪可显著舒张气管平滑肌（P＜0.01）；用肌浆网钙泵抑制剂TSG孵育40分钟，以耗竭肌浆网储存的Ca2+，此时川芎嗪仍然具有舒张气道平滑肌的效应（P＜0.01），TSG对TMP的效应无显著影响（P＞0.05）。

表1 细胞外钙在川芎嗪舒张豚鼠气管平滑肌效应中的作用(±s，10-3N)

表1 细胞外钙在川芎嗪舒张豚鼠气管平滑肌效应中的作用(±s，10-3N)

注：n=10；组间比较指两组差值的组间比较

有钙＋TMP 14.70 12.84±1.011.86±1.01 5.849 ＜0.01有钙＋TSG＋TMP 14.70 12.43±1.322.27±1.32 5.416 ＜0.01组间比较 0.774 0.449

2.3 细胞内钙在川芎嗪舒张效应中的作用

结果见表2。在无钙K-H液中，川芎嗪对气管平滑肌的舒张作用虽然也达到显著性差异的水平（P＜0.05），但其效应较弱；而经TSG预孵后，其对气管平滑肌无明显舒张效应（P＞0.05），两组间比较无显著差异（P＞0.05）。川芎嗪在无钙K-H液中对气管平滑肌的舒张效应（（0.17±0.21）×10-3N）明显比其在有钙K-H液中的效应（（1.86±1.01）×10-3N，见表1）弱（t＝5.181，P＜0.01）。

表2 细胞内钙在川芎嗪舒张豚鼠气管平滑肌效应中的作用(±s，10-3N )

表2 细胞内钙在川芎嗪舒张豚鼠气管平滑肌效应中的作用(±s，10-3N )

注：n=10；组间比较指两组差值的组间比较

无钙＋TMP 14.70 14.53±0.210.17±0.212.6120.028无钙＋TSG＋TMP 14.70 14.52±0.320.18±0.321.8220.102组间比较 0.0520.959

3 讨 论

抑制气道平滑肌痉挛是哮喘治疗中的重要措施，而气道平滑肌的痉挛与钙离子介导的兴奋-收缩耦联机制密切相关。兴奋－收缩耦联中的重要离子Ca2+来源于胞外Ca2+内流或肌质网的Ca2+释放。为探讨川芎嗪对气道平滑肌的作用机制是否与影响胞外Ca2+内流或肌质网Ca2+释放有关，本实验观察了有Ca2+和无Ca2+环境中川芎嗪对离体豚鼠气管平滑肌环的效应，并且利用肌质网Ca2+泵抑制剂thap sigargin（TSG）耗竭肌质网的Ca2+，以观察其对川芎嗪气道平滑肌作用效应的影响，从而为探讨川芎嗪的作用机制提供实验依据。

本实验的结果显示，川芎嗪具有舒张正常离体豚鼠气管平滑肌的作用。其舒张效应呈剂量依赖性（10-6～10-3mol/L）。说明川芎嗪具有潜在的临床应用价值。

在有钙K-H液中，用肌浆网钙泵抑制剂TSG耗竭肌浆网储存的Ca2+，此时气管平滑肌的舒缩状态主要受细胞外Ca2+的影响，实验结果显示川芎嗪仍然具有舒张气道平滑肌的效应，与未加TSG组的效应无显著差异。表明川芎嗪对离体气道平滑肌的舒张效应与肌质网Ca2+（细胞内钙）释放的关系不明显，即可能主要是通过抑制细胞外Ca2+的内流而实现的。

为了进一步阐明Ca2+在川芎嗪舒张气道平滑肌中的作用，本实验还在无钙K-H液中进行了观察，此时气管平滑肌的舒缩主要受肌质网Ca2+（细胞内钙）的影响。结果显示，在无钙K-H液中，川芎嗪对气管平滑肌虽然也有一定的舒张作用，但与其在有钙K-H液中的作用相比明显减弱；TSG在无钙K-H液中对川芎嗪的效应无明显影响。这些结果进一步提示，川芎嗪主要是影响细胞外Ca2+内流而产生舒张效应的，肌质网Ca2+（细胞内钙）对其作用无明显影响。有报道表明，可抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞电压依赖性钙通道[6]，提示，川芎嗪对气道平滑肌的舒张效应可能与抑制钙通道有关。

综上所述，川芎嗪可对正常豚鼠离体气管平滑肌产生明显舒张作用，其效应的产生可能与细胞外Ca2+内流的抑制有关。

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[5] 曲悦君,白洪波,王超智,等.川芎嗪抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用[J].中国药理学通报,2010,26(6): 814-818.

[6] 尹春萍,张立冬,刘继红,等.N-( 3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰基)-N’-( 4-氟基苯基)哌嗪对平滑肌细胞游离钙浓度的影响[J].中国医院药学杂志,2009,29(15): 1264-1267.