顺铂纳米载体体外抗肿瘤作用的比较研究

孙晓译，梁文权

(1.浙江大学城市学院医学与生命科学学院，浙江杭州310015;2.浙江大学药学院，浙江杭州310058)

目前，广泛研究和使用的亲水性药物纳米载体主要有脂质体、纳米粒、聚合胶束等。药物载体的化学组成和物理结构，会通过改变药物的释放行为［1］、粒子表面特性、与细胞膜及其它成分的相互作用力［2］、细胞转运途径［3］，从而最终影响药物的疗效。面对各种可供选择的药物载体，如何进行合理选择成为人们关注的问题。目前的研究多针对一种纳米载体进行结构修饰或改变，但平行比较多种载体的研究少有报道。

顺铂是一种水溶性细胞周期非特异性抗肿瘤药物，对于卵巢癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、头颈部鳞癌等多种实体肿瘤均有疗效［4］。但因为存在肾脏毒性、神经毒性、骨髓抑制和胃肠道反应等严重的毒副作用［5］，因此临床应用受到了一定的限制。目前有许多给药系统，如脂质体［6］、纳米粒［7］、纳米囊［8］等正处于研究和开发之中，以期能达到在靶部位缓慢释放药物、减少给药剂量和降低药物毒性的作用。其中研究较为成熟的是顺铂脂质体和明胶纳米粒。

本研究选用顺铂作为水溶性药物的模型药物，以顺铂脂质体和顺铂明胶纳米粒为纳米载体的研究对象，通过平行的细胞摄取、消除、内吞抑制、体外抗肿瘤等实验，比较两种纳米载体在敏感细胞A549中的转运和抗肿瘤作用的区别与特点，为顺铂的载体选择提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 顺铂(CDDP)购自山东齐鲁制药厂;氯丙嗪(CPZ)、细胞松弛素D(CytD)、非律平Ш(Filipin Ш)购自Sigma公司;氢化大豆磷脂(HSPC)和胆固醇由Lipoid公司提供;铂标准液、115In标准液购自上海晶纯试剂有限公司。DMEM培养基、小牛血清、胰酶和青霉素-链霉素双抗试剂购于Gibico公司。

1.2 细胞株 人肺腺癌A549细胞系从中科院上海生科院购得。

1.3 顺铂脂质体及顺铂明胶纳米粒的制备顺铂脂质体(CDDP-liposome)根据文献［9］稍经修改制备。65℃搅拌下溶解20 mg顺铂于2 ml生理盐水。250 mg HSPC和50 mg胆固醇溶于乙醇后，将其滴入顺铂溶液中搅拌，保持混悬液65℃，1 h。将脂质悬液进行探头超声，趁热过0.22 μm滤膜。滤液室温放冷，过0.45 μm滤膜除结晶药物。滤液于透析袋(MWCO:14 kDa)室温透析除去游离药物。

顺铂明胶纳米粒(GPs-Pt)用两步去溶剂法制备［7］。磁力搅拌下将丙酮滴加至4%(w/v)明胶溶液(以1 mol/L盐酸调节pH2.5)，纳米粒悬液以0.2%戊二醛交联过夜。明胶纳米粒离心收集，并用水洗除有机溶剂及交联剂。将制得的空白纳米粒分散于1 mg/ml顺铂水溶液中，37℃振摇反应24 h。未结合的顺铂依上法离心、水洗去除。冷冻干燥即得。

1.4 纳米载体的表征 取CDDP-liposomes和GPs-Pt，用PBS稀释至合适浓度，激光衍射粒度分析仪测定粒径分布和表面电位。

透析法(MWCO:14 kDa)测定顺铂纳米载体的体外释放。透析液为DMEM培养液。37℃，75次/min振摇条件下，间隔一定时间取样。

载药量测定:将一定量的顺铂脂质体或纳米粒消解，按1.5项下处理，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定含量。

1.5 Pt含量测定 取待测细胞样本，加入115In内标液(1 μg/ml)50 μl，再加入 5 ml 65%HNO3，于120℃中消解。溶液近干时，加超纯水5 ml，再加热至近干。重复以上步骤，至棕色气体消失，溶液透明清亮，最后用超纯水定容至5 ml，ICP-MS 进样分析。

1.6 细胞摄取与消除 细胞以5×105个/孔接种，过夜。摄取时给药浓度20 μg/ml，孵育3 h。PBS洗涤后，加内标，按1.5项下消解细胞，用于整体细胞Pt含量测定。胞内Pt含量测定时，PBS洗涤细胞后用胰酶消化细胞，离心、洗涤并收集细胞后消解，用于ICP-MS定量。

消除实验前，先进行细胞摄取。后以PBS洗去药液，以新鲜培养液培养细胞，记录该时间点为消除起点。于一定时间点，胰酶消化、收集细胞。按1.5项下处理样品，用于胞内Pt含量测定。

1.7 内吞抑制 细胞5×105个/孔接种。含内吞抑制剂的培养液与细胞孵育30 min后，加入含药载体(20 μg/ml CDDP)，继续培养1 h。PBS洗涤，胰酶消化收集细胞，按照1.5项下消解细胞测定Pt浓度。各抑制剂浓度:50 mmol/L 2DG/0.05%NaN3，10 μg/ml CPZ，2 μmol/L CytD，1 μg/ml filipin Ш。低温摄取时，细胞预先在4℃条件下放置30 min后低温摄取1 h，其余操作同前。

1.8 细胞毒性实验 细胞1×104个/孔接种，过夜。加入不同浓度的药液，培养72 h后，MTT法测定细胞毒性。

1.9 统计学处理 数据以“均数±标准差”表示，采用方差分析或t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米载体表征 顺铂脂质体和明胶纳米粒的粒径、电位及载药量，如表1所列。体外释放以顺铂溶液为对照，结果显示两种载体72 h内药物释放约30%，其中脂质体的释放较明胶纳米粒更慢(72 h，P ＜0.05，图1)。

表1 顺铂脂质体和顺铂纳米粒的粒径、电位和载药量Table 1 Size，zeta potential and drug loading of CDDP-liposomes and GPs-Pt

图1 顺铂脂质体和顺铂纳米粒体外释放曲线Fig.1 In vitro release of CDDP solution，CDDP liposomes and GPs-Pt

2.2 细胞摄取 经细胞摄取3 h后，纳米粒组胞内和总体细胞Pt水平均显著高于脂质体(P＜0.05)。但其胞内Pt浓度低于溶液组(图2A)。明胶纳米粒细胞膜吸附能力强，约占细胞总量的80%。

2.3 内吞途径 低温摄取显著降低了胞内药物含量，CPZ显著抑制了明胶纳米粒和脂质体的细胞摄取(P＜0.05)。Filipin Ш的存在对顺铂溶液和两种纳米载体的细胞摄取均无影响。CytD减小了纳米粒和脂质体的细胞内化，脂质体组胞内Pt含量减小了45%，纳米粒组减小了15%(图2B)。

2.4 细胞消除 顺铂的细胞消除动力学曲线见图3A。脂质体组4 h内约15%的药物被清除出细胞，顺铂溶液消除比例相似。纳米粒组胞内Pt含量下降最多(50%)，各时间点的消除比例较脂质体组均有显著性差异(P＜0.05)(图3B)。根据一室模型计算得各药动学参数如表2。脂质体组的消除速率常数小于纳米粒，k约为后者的1/3。脂质体的胞内滞留能力大，MRT约为20 h，与溶液组接近。

2.5 细胞毒性实验结果 两种空白载体在实验浓度条件下，均未发现明显的细胞毒性。载药颗粒的抗增殖作用和IC50值见图4。顺铂脂质体体外抗肿瘤活性显著大于纳米粒。

表2 顺铂细胞消除动力学参数Table 2 Cellular efflux parameters for CDDP and CDDP-nanocarriers

3 讨论

为保证载体可比性，我们通过调节工艺制备了粒径、电位、载药量、体外释放相近的两种顺铂载体。脂质体和纳米粒72 h累积释放约30%，可保证后续的细胞实验过程中药物不从或仅少量从系统中释放，避免游离药物摄取而干扰实验结果。

图4 顺铂脂质体和纳米粒体外抗肿瘤活性(A)和IC50值(B，与顺铂溶液比较，*:P＜0.05)Fig.4 Cytotoxicity of CDDP-nanocarriers and CDDP solution towards A549 cells(A)and their IC50s(B，*:P ＜0.05 vs CDDP)

从Pt摄取结果分析，两种纳米载体均能不同程度地被细胞摄取。胞内药物含量以顺铂溶液为最高，两种载体中，明胶纳米粒的摄取水平较高。这主要和药物内化效率有关。顺铂分子是通过被动扩散和铜离子转运蛋白家族主动转运入胞的［10］，而两种纳米载体的细胞摄取均受CPZ和低温抑制，表明脂质体和纳米粒是通过相对低效的颗粒内吞途径入胞的。结合非律平和CytD的抑制结果，说明clathrin介导的内吞和大胞饮参与了脂质体的内吞，通过两种途径入胞的药物各占一半。明胶纳米粒主要依赖clathrin途径入胞，少量粒子通过大胞饮内吞。由于纳米载体构成的差异，使其内吞途径呈现出多样性［11］，继而影响内化水平和胞内传递过程。纳米给药系统的细胞膜吸附在摄取实验中普遍存在，吸附力强的粒子可在细胞表面或病变部位有更长的滞留时间，有利于持续释放药物。本实验使用了胰酶消化法来处理吸附载体［12］，两种纳米载体均增加了药物的细胞膜吸附，其中，明胶纳米粒的吸附力比脂质体更强，这与载体材料和细胞膜之间的亲和力有关。

顺铂入胞后主要与DNA和胞浆蛋白结合，游离分子通过铜外排转运体ATP7A/ATP7B［13］被排出细胞。通过对消除比例的分析我们发现，纳米粒组的药物消除率远高于脂质体和溶液组，后者的胞内滞留能力更好。以一室模型拟合计算药动学参数(表2)，结果显示脂质体的消除速率常数小于纳米粒，MRT与溶液剂相当。顺铂溶液的AUC最大，纳米粒最小。这可能和载体的胞内传递过程有关。纳米颗粒被内吞后，会经过内体、溶酶体等细胞内膜系统而被消化和降解，从而导致载体结构的破坏和药物的释放［14］。另一部分未被降解的载体颗粒则可经回收内体被视作异物排出细胞［15］。从载体消除实验结果分析，脂质体可能在胞内某些内膜结构中被破坏，将物理包裹的顺铂释放出来，游离的药物分子继而与靶点结合，因此消除比例和溶液组类似。而明胶纳米粒经过交联后在胞内的降解时间较长，小分子明胶降解片段与药物仍然以共价键的方式结合，需要通过离子交换实现顺铂的释放［16］。因此，GPs-Pt的缓慢释放使顺铂分子难以及时地与胞内靶点结合，而未完全降解的粒子则可能通过回收过程被清除出细胞。

从细胞摄取结果分析，顺铂明胶纳米粒的内化水平比顺铂脂质体高。而消除动力学结果显示，顺铂脂质体较顺铂明胶纳米粒更利于实现胞内释放和胞内滞留。在两种因素的相互作用下，我们用抗细胞增殖实验评价两种纳米给药系统的体外抗肿瘤活性。脂质体和明胶纳米粒的IC50值均大于顺铂溶液，这与动力学AUC结果相符。尽管纳米粒的胞内摄取含量高于脂质体，但后者的抗肿瘤活性显著优于前者。这与纳米粒胞内释放少、消除多有关。

纳米载体的包裹改变了顺铂入胞途径和内化水平，对后续的细胞转运和药物外排均有影响。在敏感细胞中未发现脂质体或纳米粒增强顺铂抗肿瘤活性的趋势，但颗粒包裹顺铂具备降低药物毒性［17］、胞外缓释［18］、克服多药耐药等优势［19］。在A549细胞中，顺铂脂质体较明胶纳米粒有更长的胞内滞留时间和更大的AUC，抗肿瘤活性远高于纳米粒。顺铂脂质体是更适合顺铂发挥疗效的纳米载体。

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