一氧化氮在脑缺血预处理中的作用及其机制

张 超， 季 晖， 赵 倩， 张珍珍

(中国药科大学药理学教研室，江苏 南京 210009)

脑缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)是指脑组织在经过非致死性短暂的重复缺血后，能增强其对缺血的耐受性的一种现象［1］。短暂性脑缺血诱导的脑IPC效应是一种多因素级联反应，可促进脑内神经元存活，减轻缺血后损伤。一氧化氮(NO)可调节大脑血流量和局部大脑灌注时的新陈代谢活性，对IPC的产生起着至关重要的作用。

1 一氧化氮与一氧化氮合酶

1.1 在脑内的功能

NO由一氧化氮合酶(NOS)产生，NOS具有3种亚型:神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)。在健康的大脑中，NO主要由神经元内的nNOS和内皮上的eNOS产生。在神经元中，nNOS主要存在于细胞质中，激活后迁移至细胞膜上，与谷氨酸盐依赖的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体结合并激活受体［2］。NMDA受体被激活后，引起Ca2+内流，激活nNOS产生较低水平的NO［3］。在损伤、缺氧等应激条件刺激下，可诱导胶质细胞产生iNOS，且不依赖Ca2+而持续产生并释放NO［4-5］。有研究者认为在线粒体中存在着一种新的NOS——线粒体NOS(mtNOS)，但人们对此存在争议，有人认为所谓mtNOS可能只是线粒体中的nNOS［6］。

NO可介导谷氨酸盐信号，并对细胞－细胞间的信号传导产生影响，而谷氨酸盐信号在长期增强或者减弱的过程中，NO可能发挥一个神经兴奋传递的反馈传感器作用，这种反馈对于突触前/后膜的兴奋传递和神经网的活性很重要。作为内皮细胞衍生舒张因子，由eNOS和nNOS产生的NO可通过调节局部大脑血流量增加神经元活性。

1.2 在脑缺血后的作用

研究表明，健康脑内的NO浓度是纳摩尔水平，然而脑缺血后其浓度升至微摩尔水平，这缘于nNOS的激活。NOS在脑缺血后的作用可被分为两个方面，即调节血管功能(由eNOS介导)和产生毒性作用(初期由nNOS介导，后期由iNOS介导)。

有研究者曾在nNOS基因敲除小鼠实验中发现，nNOS基因敲除小鼠在脑缺血后脑内NO水平没有增加，并对局部缺血和全脑缺血产生耐受。脑缺血诱导nNOS合成的NO对组织的损伤机制包括:致聚ADP-核糖聚合酶(PARP)激活，导致细胞储存能量耗尽［7］;与超氧化物结合生成亚硝酸盐;诱导细胞凋亡(Elibol等，Neuroscience，2001 年)。与nNOS基因敲除小鼠实验的结果一致，nNOS抑制剂也可使动物模型对缺血产生耐受(Yoshida等，J Cereb Blood Flow Metab，1994 年)。

已有研究表明，在脑缺血开始阶段，iNOS在脑内并无表达，直到几天后，胶质细胞和炎症细胞进入了缺血核心区，方才有表达，而由iNOS产生的NO则可加重组织损伤。Ono等［8］证实小胶质细胞中因iNOS激活所产生并释放的NO与缺血后延迟性神经元损伤密切相关，且使用iNOS特异性抑制剂或在iNOS基因敲除模型小鼠中进行的实验也证明，抑制iNOS的表达，可减轻这种损伤(Iadecola等，Neuroscience，1997 年)。

与nNOS和iNOS的毒性作用不同，eNOS在脑缺血后可发挥脑血管保护作用，即舒张血管和抑制血小板聚集及白细胞与内皮细胞黏附。实验表明，在脑缺血后，eNOS基因敲除小鼠与野生型小鼠相比，其脑内有更大的核心缺血区和更小的半影区，这可能缘于其缺失eNOS的脑血流量调节作用(Huang等，J Cereb Blood Flow Metab，1996年)。

2 脑缺血预处理机制

IPC可出现在不同的组织中，如心脏、大脑、肝、肺和胃肠道片段［9-10］，但是其在各组织中的激活和调控机制是否一样尚不得而知。IPC的一些保护机制已被证实，如改变细胞基因、上调热休克蛋白、减少脂过氧化反应、促进炎症和线粒体新陈代谢等［11-15］，但其分子机制也不十分清楚。

依据短暂性缺血后产生保护效应的时间间隔的不同，脑IPC可分为两种类型:即时型(early preconditioning)和延迟型(late preconditioning)，即 IPC的保护效应呈“双峰”时相。前者在短暂性缺血后数分钟至3 h内即产生保护效应，而后者的保护效应则出现在短暂性缺血后24～72 h，两者的病理生理及保护机制不同。即时型IPC因为在短暂性缺血后很快产生，仅被认为是翻译前水平的调控，不像延迟型IPC涉及到基因表达的改变，因此其保护效应产生的时间较短。

对脑IPC的研究起初采用了沙土鼠的全脑缺血模型，结果显示，阻断双侧颈总动脉达5 min，即可造成海马CA1区的神经元损伤，而若在此前预先致脑形成2 min的短暂性缺血，则可减轻随后缺血造成的CA1区神经元损伤，提示短暂性缺血可对脑组织产生保护效应;但这种保护效应在1～3 d后才出现，说明这是一种延迟型IPC效应。最新研究表明，NMDA受体的激活和相关蛋白的合成是延迟型IPC产生的必要条件［16］。

尽管IPC确切的信号分子尚不明确，但其延迟保护效应的一些激活分子已被人们发现，包括腺苷、缓激肽、细胞因子、NO和活性氧(ROS)。这些分子可以激活IPC的上游信号，其中有些分子与NOS的激活相关，提示NO的产生可能是延迟型IPC效应产生的关键。

3 对一氧化氮在脑缺血预处理中作用的研究

3.1 体外模型实验研究

缺氧－缺糖(OGD)模型可用于对原代神经元或PC12细胞进行的体外模拟脑缺血研究。在神经元细胞培养模型中，短暂的OGD可诱导IPC效应，表现为神经元的抗氧化应激能力增强。然而，细胞培养模型只能用来研究神经元产生IPC的内源性通路［17］，并不能阐明血管的作用和不同组织结构之间的相互作用对IPC产生的影响。

体外实验显示，神经元细胞经5～30 min的OGD处理后，对24 h后45～55 min的OGD损伤有保护作用(Grabb等，J Neurosci，1999年)。这种IPC效应与NMDA受体激活、Ca2+内流和新蛋白合成相关，而L-NAME可阻断此IPC效应，提示NO参与了此IPC效应的产生。使用原代皮层细胞培养模型进行的实验还发现，NMDA受体兴奋后，激活nNOS，导致NO水平升高，继而激活可抑制Ras相关信号传导的p21 Ras，产生IPC效应，而使用p21 Ras显性失活突变体或者p21 Ras抑制剂可以阻断IPC效应，提示下调Ras相关信号，包括Raf/MEK/ERK通路传导，可能改变基因表达，并刺激神经元生长和存活相关程序，从而诱导IPC效应(Gonzalez-Zulueta等，Proc Natl Acad Sci USA，2000 年)。

3.2 体内模型实验研究

小鼠实验显示，连续将大脑中动脉阻断(MACO)3次(每次持续5 min)，对30 min后永久性脑缺血损伤有保护作用，24 h后的脑梗死体积检测验证了这一点(Stagliano等，J Cereb Blood Flow Metab，1999 年)。Atochin等［18］在 eNOS 和 nNOS 基因敲除及野生型小鼠实验中采用同样的方法考察了eNOS和nNOS在IPC中的必要性，其间采用多普勒血流仪记录血流量变化。结果表明，野生型小鼠经过3次MACO后，可使永久性脑缺血24 h后的脑梗死体积减少，但eNOS和nNOS基因敲除小鼠却未见有此IPC效应。

在新生小鼠缺氧－缺血模型中，IPC效应可以被非特异性NOS抑制剂L-精氨酸(L-NAME)而并非nNOS特异性抑制剂7-硝基吲哚(7-nitroindazole)和iNOS特异性抑制剂氨基胍(aminoguanidine)所拮抗(Gidday 等，J Cereb Blood Flow Metab，1999 年)。Gustavsson等［19］在同一模型试验中也证实eNOS的基因表达与脑IPC效应相关，即eNOS基因表达的增加可致大脑血管舒张及血流量增加，从而产生IPC效应。

大鼠实验显示，给予3 min短暂的MACO或脂多糖(LPS)，可产生脑IPC效应。其中，由LPS诱导的IPC效应被认为与eNOS表达的增加有关，可被非特异性NOS抑制剂L-NAME阻断，然而，L-NAME却不能抑制短暂性MACO所致IPC效应(Puisieux等，Eur J Pharmacol，2000年)。这一实验结果与之前人们的研究结果出现偏差，究其原因，可能是实验动物种群差异(大鼠 vs小鼠)、模型差异(3 min MACO 1次 vs 5min MACO 3次)和L-NAME不能有效阻断eNOS表达所致。eNOS诱导脑IPC效应的可能机制是，舒张大脑血管，增加缺血半影区血流量，从而减小脑梗死体积;且与干预白细胞－内皮细胞以及血小板－内皮细胞间相互作用有关(Jiang等，Brain Res，2002 年)。

挥发性麻醉剂也可诱导脑 IPC效应，Wang等［20］认为这和蛋白激酶B(Akt)的激活以及三磷酸腺苷(ATP)依赖性通道等与NO密切相关的信号通路有关。给大鼠腹腔注射异氟烷或者氟烷后24 h，再行2 h MACO，则可产生脑IPC效应，而iNOS抑制剂氨基胍可阻断此IPC效应，提示iNOS参与了这些麻醉剂诱导IPC效应产生的过程(Kapinya等，Brain Res，2000 年)。Kitano 等［21］在小鼠实验中发现，使用异氟醚诱导脑IPC效应，存在性别差异，即此诱导方法只对雄性小鼠有效，而对于雌性小鼠无效。这种性别差异来自于Akt的活性差异，继而改变下游eNOS的活性。

综上所述，NO在IPC中的作用可分为以下两个方面:第一，可能通过内源性通路参与IPC效应，发挥触发器和调控器双重作用，调节神经元对脑缺血的耐受;第二，作为内皮细胞衍生舒张因子，可在脑缺血后增加灌注血流量，抑制内皮细胞、血小板和白细胞的相互黏连，从而降低脑缺血所致血管功能性损伤。

4 对一氧化氮在脑缺血预处理中作用机制的研究

已有研究表明NO在IPC中的作用机制涉及以下途径:1)Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt通路，NO可激活这两条通路，并产生级联反应，如细胞骨架蛋白磷酸化、细胞黏附分子磷酸化以及转录因子［如Elk-1、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)、NF-κB等］的激活，而转录因子的激活又可以导致基因表达的变化，触发 IPC效应;2)NF-κB通路，NF-κB参与了由细胞因子和生长因子引起的细胞分化、凋亡和生存过程，而短暂性脑缺血诱导产生的NO可激活NF-κB，并诱导产生iNOS，引发IPC效应;3)线粒体K+-ATP通道，一种ATP敏感性的K+通道，被认为可能是延迟型IPC的效应器，而NO可以选择性激动线粒体K+-ATP通道。

4.1 Ras/Raf/MEK/ERK通路

Ras/Raf/MEK/ERK通路可调节细胞增殖、分化、存活、凋亡的基本过程。研究表明，由nNOS产生的NO可激活G蛋白Ras(Gonzalez-Zulueta等，Proc Natl Acad Sci USA，2000 年)，使之结合 Ras激酶，并迁移到细胞膜表面;Ras激活丝苏氨酸激酶Raf，继而激活MEK激酶家族(MAPK/ERK激酶，MEK1和MEK2)，MEK又致ERK激酶家族(ERK1和ERK2，即p42和p44)磷酸化并激活，而ERK激酶是这个级联反应的效应分子，不仅可致细胞质中靶蛋白磷酸化，还可致核蛋白和转录因子，如CREB和Elk-1磷酸化(见图1)［16］。此外，体外神经元培养模型实验发现，ERK的激活与 IPC效应相关(Kolch等，Biochem J，2000年)。笔者所在课题组进行的大鼠实验也显示，IPC模型大鼠在脑缺血再灌注后脑内磷酸化ERK(p-ERK)水平升高，而其接受新型NO供体型化合物(S)-ZJM-289治疗后，IPC效应增强，且其脑内p-ERK表达水平进一步提高，提示(S)-ZJM-289增强IPC效应的作用可能与ERK蛋白的激活相关。

4.2 PI3K/Akt通路

NO激活的Ras也可通过促进生长因子与酪氨酸激酶受体或者G蛋白偶联受体结合而激活PI3K/Akt通路［15］。3-磷酸磷脂酰肌醇激酶(PI3K)被激活后，可水解细胞膜上 4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)生成第2信使 PIP3，而PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(PDK)结合，促使PDK致Akt磷酸化并激活(见图1)。

Akt也称蛋白激酶B(PKB)，是一种相对分子质量为60000的丝氨酸/苏氨酸激酶，具有3种亚型，其中 Akt1是与大脑功能密切相关的一种亚型［22］，可在 4 个位点(Ser124、Thr308、Thr450 和Ser473)被PDK磷酸化，且Thr308和Ser473位点的磷酸化可增强Akt1激酶活性。Akt1激活后可致丝氨酸和苏氨酸磷酸化，继而影响诸多靶点，如基因转录调控蛋白(如 FOCO、IKK、mdm2等)、细胞质酶、组蛋白和细胞程序化死亡相关蛋白(如BAD、Bax、Caspase 9等)。

细胞内钙浓度的增加可以激活nNOS和eNOS。最近研究表明，eNOS的活性也受磷酸化的苏氨酸和丝氨酸残基调控，如因Ser1179位点磷酸化而激活以及因Thr479位点磷酸化而失活［23］。Akt激酶可致eNOS在Ser1179位点磷酸化并激活，是重要的体内eNOS调控因子，其介导的eNOS磷酸化改变了细胞对生长因子如胰岛素样生长因子(IGF-1)的应答。除Akt以外，其他激酶，如PKA、AMPK和PKC也可致 eNOS在不同位点磷酸化，调控其活性。eNOS活性的增加对于IPC的影响机制包括:调节Caspase的表达和磷酸化、PKC通路的激活及基因表达的改变。

总的来说，Akt1及其下游信号分子可促进脑缺血再灌注后神经元的存活，与IPC效应的产生密切相关。

图1 NO经Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt通路诱导IPC的分子机制Figure 1 Molecular mechanism of NO-induced IPC via Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/Akt signal pathways

4.3 NF-κB 通路

在正常状态下，NF-κB在胞质中与其抑制因子I-κB结合而失去转录活性。短暂性脑缺血后产生的适量的NO则能促进PKC致IKK(I-κB的激酶)磷酸化并激活，导致 I-κB磷酸化及降解，使其与NF-κB 解离［24-25］，被释放的 NF-κB 转移到细胞核内并诱导目的基因表达 iNOS，激活 CREB［16］，并产生IPC效应(见图2)。笔者所在课题组研究发现，(S)-ZJM-289用于IPC模型大鼠时，可改善大鼠的神经行为学功能和脑损伤指标。且免疫组化和Western Blot实验显示，给IPC模型大鼠使用了(S)-ZJM-289后，大鼠脑内NF-κB和eNOS蛋白表达上调，表明(S)-ZJM-289可通过激活eNOS，释放NO，促进NF-κB-I-κB解偶联，致NF-κB 活化并进入细胞核内进行iNOS基因转录，从而增强IPC效应。

图2 NO经NF-κB通路诱导IPC的分子机制Figure 2 Molecular mechanism of NO-induced IPC via NF-κB singal pathway

4.4 线粒体K+-ATP通道

线粒体K+-ATP通道是脑内产生IPC的重要靶点，而PKC的激活被认为是线粒体K+-ATP通道开放的重要环节［26］。已有研究显示，给IPC模型大鼠在脑缺血前注射K+-ATP通道拮抗剂，可阻断脑缺血后IPC效应，而K+-ATP通道激动剂在海马切片中可诱导类似IPC效应［27］;NO则可通过环磷酸鸟苷(cGMP)-PKG-PKC通路选择性激动线粒体K+-ATP通道［28-29］。最新研究表明，硝酰基和巯基等自由基也可激动该通道［30］。机制研究表明，线粒体K+-ATP通道的开放可抑制细胞膜去极化［31］，增加线粒体呼吸率(Bajgar等，J Biol Chem，2001)，减少ROS产生［32］，抑制胞内钙的超载，从而抑制神经元凋亡，产生 IPC 效应(Pain等，Circ Res，2000 年)。

5 结语

NO及其代谢物在细胞保护分子信号级联中起重要作用，可促进IPC效应的产生，对其的深入研究有积极的临床意义。笔者所在课题组研究表明，新型NO供体型化合物(S)-ZJM-289用于IPC大鼠时，可显著性降低脑缺血再灌注后的神经元损伤和脑梗死体积，改善神经学功能，其诱导IPC效应的产生与增强eNOS活性和改善线粒体功能相关，它可通过增加eNOS活性，改善内皮细胞功能，增强脑内缺血区域的微循环，促使ERK磷酸化，导致IPC效应的产生。亚硝酸盐是本课题组最新的研究重点，因为它不仅是一种稳定的NO贮存器，能在缺血后对缺血区域发出类似NO的信号，其具有的氧化还原特性又令它在这个信号通路中的作用具有多样性，而且它还是IPC效应调节器，在治疗脑缺血再灌注损伤方面极具潜在价值。尽管亚硝酸盐介导IPC效应的机制尚不清楚，但现有的研究数据表明，它是缺血反馈的生理调节器，为治疗缺血性疾病的很有潜力的药物。

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