康宁木霉固态发酵生产纤维素酶与木聚糖酶的研究

邹水洋 刘传生 朱丹

(东莞理工学院 化学与环境工程学院，广东东莞 523808)

地球上最大的一类可再生有机资源——木质纤维素的生物转化与利用是全世界普遍关注的重大课题。然而，酶使用成本过高是这一生物技术迟迟难以产业化的重要障碍［1］。纤维素酶和木聚糖酶是转化木质纤维素原料生成可发酵性还原糖的主要水解酶，提高这两大类酶的生产水平是降低用酶成本的重要途径，也是该领域主要的研究方向之一。

纤维素酶和木聚糖酶的生产方法有液态发酵法和固态发酵法，这两种方法各有优劣。一般认为，液态发酵培养条件易控制，生产效率高，产品品质稳定，适合大规模工业化生产，但投资费用及运行成本较高［1］。而固态发酵由于其特有的经济、实用性，近年来在纤维素酶和木聚糖酶的生产方面已经引起了广泛的重视［1-3］。以前曾对一株纤维素酶和木聚糖酶的高产菌——康宁木霉QF-02的液态发酵工艺开展了系列研究，并达到了较高的产酶水平［4-5］。为进一步拓展该菌种的生产应用，本文对其固态发酵工艺进行研究，并采用稻草和麸皮这类廉价的原料作为主要的培养基质以降低生产成本。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种:康宁木霉 (Trichoderma koningii)QF-02由东莞理工学院微生物实验室保存。

原料:稻草、麸皮粉碎，75℃烘干，过20目筛备用。

试剂:Whatman 1#滤纸、木聚糖、水杨素由Sigma公司生产 (用于酶活力测定)，其它化学试剂均为国产分析纯或生化试剂。

菌种保藏培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)。

Mandels营养液［6］:0.75 g蛋白胨，0.25 g酵母膏，0.3 g脲，1.4 g(NH4)2SO4，2.0 g KH2PO4，0.4 g CaCl2·H2O，0.5 mg FeSO4·7H2O，4.0 mg ZnSO4·7H2O，2.0 mg CoCl2·6H2O，溶于1000 mL蒸馏水中。

种子液培养基:1.0 g葡萄糖溶于100 mL Mandels营养液中，于110℃灭菌20 min。

固态发酵培养基:稻草粉、麸皮按质量比 (w/w)3∶2混合，总量5 g，装于250 mL锥形瓶中，加入pH 5.0的Mandels营养液7.5 mL，搅拌均匀，于121℃灭菌20 min。本培养基为发酵初始培养基，在研究过程中工艺条件的改变将另行指出。

1.2 实验方法

种子液制备:菌种在PDA培养基上28.5℃培养7天，长满孢子后冷藏备用。从斜面培养基上取孢子一环接种到种子液培养基，于28.5℃、150 r/min转速下培养48 h。

固态发酵:在固态培养基中接入种子悬浮液1.0 mL，充分搅拌后在SPX-250型生化培养箱28.5℃静置培养4天。以上实验均平行做3个样品，实验结果取其平均值，标准偏差小于5%。

粗酶液的制备:将固态培养物加入100 mL蒸馏水，在40℃下振荡 (60 r/min)浸提2 h;然后用棉花过滤，滤液经4000 r/min离心15 min去除孢子，上清液即为粗酶液。

1.3 检测方法

滤纸酶活 (FPA)和β-葡萄糖苷酶活的测定参照 Mandels等人的测定方法［7］，酶解底物分别为Whatman 1#滤纸和水杨素，以葡萄糖为标准按DNS法定糖。木聚糖酶活的测定根据文献［8］略加修改:取适当稀释的酶液0.5 mL，加入1.0 mL质量分数为1%的木聚糖溶液 (木聚糖溶于pH 4.5的0.1 mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中)，于50℃保温15 min，以木糖为标准按DNS法定糖。以上酶活测定中均以底物空白与酶液空白的算术和作为总空白值处理［9］。酶活力以每分钟水解底物生成1 μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力国际单位 (IU)。固体曲的活力以每克干曲计。

2 结果与讨论

2.1 稻草粉和麦麸比例对产酶的影响

在固态发酵生产纤维素酶或木聚糖酶的工艺中一般都会用到一种纤维素原料 (如稻草、蔗渣、麦糟等)与麸皮按一定比例混合作为固态基质。从实验结果 (表1)来看，稻草粉与麸皮比例为3∶2(w/w)时，T.koningii QF-02所产生的纤维素酶活和木聚糖酶活均最高。在混合基质中，纤维素物质可作为碳源和产酶诱导物。而麸皮的作用比较微妙，有人认为麸皮含有促进微生物生长和产酶的因子，且能吸收水分保持湿润;但麸皮用量过大使培养基粘性增大、不利于透气，从而影响霉菌的生长和酶的分泌［10］。笔者认为过多的麸皮除了上述不利影响外，可能还会导致营养过剩而降低酶产量，因为纤维素酶和木聚糖酶一般需要在易利用碳源相对贫乏的状态下产生。

T.koningii QF-02在液态发酵生产的纤维素酶系中，β-葡萄糖苷酶活相对较低［4-5］，与FPA的比值在1∶3～4，但在本研究中这一比值接近1∶1，表明纤维素酶系组成更趋合理，这可能是固态发酵更符合康宁木霉的自然生长习性的缘故。但木聚糖酶与FPA的比值与液态发酵相比有所下降。

表1 稻草与麸皮比例对产酶的影响 IU/g

2.2 原料粒度对产酶的影响

在研究T.koningii QF-02的液态发酵过程中，曾发现原料粒径对产酶也有一定影响，因此本实验将20目、20～40目、40目粒径的稻草与麸皮原料配制成培养基，考察不同粒度对T.koningii QF-02产酶的影响。

实验结果 (图1)显示，原料粒径在20～40目时所得酶活最高，20目时酶活略低，40目时差距较大。这可能是由于原料过细，培养基容易板结，影响到氧气和热量的传递，不利于菌体的生长，从而降低了酶的产量;而原料过粗使菌种对原料的利用率降低，同样会影响到酶的产量。但采用20～40目的原料会造成较多细小颗粒的浪费，从节约原料与提高产量综合考虑，以下实验均取用20目的稻草粉和麸皮为原料。

2.3 培养基料液比对产酶的影响

图1 原料粒度对产酶的影响

Mandels营养液包含复合氮源、矿物质及生长因子，其添加量还决定培养基的潮湿程度。实验中发现，水分太少时，固体培养基外观干燥、松散，菌体生长所需的水分及营养供应不足，代谢减弱，造成酶产量较低;水分过多时，培养基聚集呈块状，使透气性下降，有氧呼吸减弱，同化作用受到抑制［11］，酶的产量也降低。当料液比为1∶1.5(w/v)时，培养基全部润湿，结构蓬松分散，菌体对固体料的利用率较高，酶产量也是各种料液比中最高的 (如表2所示)。以下实验的料液比均采用1∶1.5。

表2 培养基料液比对产酶的影响 IU/g

2.4 培养基起始pH值对产酶的影响

Mandels营养液中含较多的KH2PO4，缓冲能力强，本实验用 H2SO4和 NaOH来调节其pH值分别为:4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5来考察pH值的改变对产酶的影响，实验结果如图2所示。随着起始pH值的升高，固体发酵所产生的纤维素酶和木聚糖酶的活力都逐渐升高，在pH 5.5时酶活最高，随后下降明显。T.koningii QF-02在液态发酵时产酶的最适pH在4.5～5.0［4-5］，在固态发酵中最适产酶pH的升高可能与该菌所处的生长环境发生了重大变化有关。以下实验的起始pH值均调节为5.5。

图2 培养基起始pH值对产酶的影响

2.5 培养时间对产酶的影响

图3 培养时间对产酶的影响

培养开始后每隔24 h定时取样测定三种酶的活力，直到168 h发酵过程结束。实验中观察到培养24 h后培养基表面就有大量白色菌丝生长，48 h后发现有绿色孢子出现，120 h后孢子覆盖整个培养基。从酶活测定结果 (图3)来看:培养时间在96 h以前，三种酶的活力升高迅速，是主要产酶阶段;96 h～120 h增加较少，120 h FPA、β-葡萄糖苷酶活、木聚糖酶活均达到峰值，分别为13.1 IU/g(干曲)、12.2 IU/g(干曲)、994.7 IU/g(干曲)。此时，应及时收获酶，否则酶活力随即下降。究其原因，一方面是因为酶的合成基本停止，另一方面由于内源性蛋白酶的水解作用［12］，目标酶蛋白会逐渐变性失活。

3 结论

菌种T.koningii QF-02在稻草粉与麸皮比为3∶2，粒径为20目，料水比为1∶1.5，起始pH值5.5，28.5℃培养120 h的优化培养条件下达到了同类文献报道的较高产酶水平，其FPA、β-葡萄糖苷酶活、木聚糖酶活分别为13.1 IU/g(干曲)、12.2 IU/g(干曲)、994.7 IU/g(干曲)。研究结果初步表明T.koningii QF-02的固态发酵工艺是可行的，且纤维素酶系组成更为合理。至于该菌的固态发酵工艺与液态发酵工艺的优劣评价目前还无法得出明确的结论，需要从具体的生产条件、生产规模以及资金与市场因素等多个方面综合考虑。

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