UPLC-MS/MS测定beagle犬内西罗莫司血药浓度

陈 咏，林 晨，张 晶，邱 彬，周 欣，宋洪涛(.福州大学化学化工学院 ，福建 福州 50002;2.福建卫生职业技术学院，福建 福州 500;.福建省药品检验所，福建 福州 50025;.南京军区福州总医院药学科，福建 福州 50025)

西罗莫司 (sirolimus，rapamycin，SRL)是一种新型、强效的免疫抑制剂，1999年10月在美国首次上市，用于预防器官移植患者的急性排斥反应［1］。西罗莫司具有骨髓抑制和高血脂的不良反应，文献［2］表明西罗莫司谷浓度与其免疫抑制效价和药物副作用有关。因此本课题组将其制备成缓控释制剂，以降低达峰浓度，维持较为平稳的血药浓度，使药物的有效性、安全性及适应性均有所提高。由于西罗莫司的生物利用度比较低，个体差异大，治疗指数窄［1］，需要灵敏的检测方法，所以本文拟建立UPLC－MS/MS的方法来测定西罗莫司在beagle犬全血中的药物浓度，用于研究西罗莫司制剂在beagle犬体内的药动学特征，为人体研究及临床合理用药提供参考。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂 西罗莫司对照品(SRL，含量99.9%，福建科瑞药业有限公司，批号070703);他克莫司对照品(tacrolimus，FK506，含量 99.9%，福建科瑞药业有限公司，批号080301);乙腈、乙醚为色谱纯、水为高纯水。

1.2 仪器 Agilent 6410高压液相色谱质谱仪(包括1200系列HPLC:G1312B二元泵，G1379B脱气机，G1367C自动进样器;G1316A柱温箱;G6410AA质谱仪:四极杆串接质谱仪，API－ES电喷雾源，G1947B大气压化学电离源，美国 Agilent公司);TDZ5－WS型多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);WH－1微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。

1.3 试验动物 6只健康beagle犬(南京军区福州总医院比较医学科实验动物中心，动物合格证号为SCXK(川)2004－15)，体重为(12.4 ±2.16)kg，受试犬无肝肾功异常，近两周未使用过任何药物。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的建立 色谱柱为Agilent C18柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美国 Agilent公司);预柱为C18柱(4.0 mm × 3.0 mm，5 μm，美国 Agilent公司);流动相为乙腈－水(90∶10，v/v);流速为 0.30 ml/min;进样量为20 μl;柱温为50℃;进样室温度为4℃。

2.2 质谱条件的建立 离子源为ESI源;正离子方式检测;扫描方式为多反应监测(MRM);离子源电离电压为3 500 V;离子源温度350℃;雾化气流速10 L/min;用于定量分析的离子反应分别为m/z 936.6→m/z 409.7(西罗莫司)和 m/z 826.6→m/z 415.4(内标他克莫司)(见图 1，2);碎裂电压(fragmentor)分别为290 eV和230 eV;碰撞能量(collision energy)分别为63 eV和60 eV;扫描时间为200 ms。

2.3 溶液的配制

2.3.1 SRL标准溶液的制备 精密称取SRL对照品10 mg，置100 ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液适量，分别配制成浓度为5、10、20、40、60、80、100、120 ng/ml的系列标准溶液。

2.3.2 内标溶液的制备 精密称取他克莫司对照品10 mg，置100 ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度线，摇匀。取该溶液适量，配制成浓度为20 ng/ml的内标溶液。

2.4 全血样本处理方法 向500 μl全血中依次加入100 μl的内标溶液(0.020 ng/ml他克莫司乙腈溶液)，100 μl乙腈︰水(50∶50，v/v)和 500 μl的水，混匀后加入4 ml乙醚，涡流混合1 min，往复振荡 15 min(240 r/min)，离心5 min(3 500 r/min)，分取上层有机相于另一试管中，40℃氮气流下吹干，残留物加入150 μl流动相溶解，涡流混合，取20 μl进行UPLC－MS/MS分析。

2.5 方法专属性考察 取beagle犬的空白全血，除不加内标外，其他按“2.4”项下操作，记录色谱图(见图3);另取beagle犬的空白全血，先配制成一定浓度的标准全血样品，再依“2.4”项下操作并测定，记录色谱图(见图4);取服药后的全血样品，依“2.4”项下进行操作并测定，记录色谱图(见图5)。由图观察到，西罗莫司的保留时间约为1.167 min，内标他克莫司的保留时间约为1.144 min。全血中本底及杂质对西罗莫司和他克莫司的测定没有任何干扰。

2.6 标准曲线制备 取450 μl的空白全血数份，分别加入50 μl的SRL标准系列溶液，混合均匀。配制成相当于西罗莫司浓度为 0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00 ng/ml的标准全血样品。按“2.4”项下进行操作，记录色谱图。以待测物浓度(ng/ml)为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W=1/X2)最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程为Y=0.201 6X －0.0031，r=0.999 7。根据标准曲线，西罗莫司测定方法的线性范围为0.50 ～12.00 ng/ml。

2.7 最低定量浓度 取SRL浓度为0.50 ng/ml的标准全血样品，按“2.6”项下进行6样本分析，根据当日标准曲线求得每一样本测定浓度，求得该浓度下的西罗莫司日内精密度(RSD)为13.1%，准确度为97.0%。该结果表明LC－MS/MS法测定全血中西罗莫司的定量下限可达0.50 ng/ml。

2.8 精密度和方法回收率试验 取450 μl的空白全血数份，按“2.6”项下的方法配制低、中、高3个浓度(西罗莫司浓度分别为 1.0、4.0 和 8.0 ng/ml)的质量控制样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定3 d，记录色谱图。根据当日的标准曲线，计算质量控制样品的测得浓度，计算本法的精密度和方法回收率，详见表1。结果表明，本方法精密、准确，符合生物样本分析要求。

表1 全血样品中西罗莫司的方法回收率和精密度

2.9 全血样品萃取回收率试验 取450 μl的空白全血数份，按“2.6”项下的方法制备低、中、高3个浓度(西罗莫司浓度分别为1.0，4.0 和8.0 ng/ml)的全血样品，每一浓度进行6样本分析。同时另取450 μl的空白全血，除不加内标溶液外，按“2.4”项下操作，向获得的上层有机相中加入相应浓度的标准溶液50 μl和内标溶液100 μl，涡流混合，取混合液40 C氮气流下吹干。残留物加入150 μl流动相溶解，涡流混合，取20 μl进行LC－MS/MS分析。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。3种浓度下西罗莫司的提取回收率分别为 76.0%，81.7%，80.2%(n=6)。同样计算他克莫司的提取回收率为89.2%。

2.10 稳定性试验 取450 μl的空白全血数份，按“2.6”项下的方法配制低、中、高3个浓度(西罗莫司浓度分别为1.0、4.0 和8.0 ng/ml)的质量控制样品数份。将西罗莫司全血样品在不同温度下(25℃、4℃、－20℃)避光贮存，分别进行不同温度下不同时间的稳定性试验考察;将全血样品在－20℃下避光贮存，1周后取出在常温下解冻，分别进行1、2、3个冻融周期的稳定性试验考察。根据当日的标准曲线，计算质量控制样品的测得浓度，结果表明西罗莫司在冷冻(－20℃)条件下至少能稳定15 d，准确度为85.2% ～95.0%(n=6);在4℃条件下至少能稳定 8 h，准确度为 85.0% ～95.9%(n=6);在室温(25℃)条件下至少能稳定 4h，准确度为85.3% ～94.5%(n=6);反复冻融 3 个周期，血药浓度未发生显著变化，准确度为85.7% ～93.6%(n=6)，均符合生物样品分析要求。

3 讨论

由于血中SRL小部分与血浆蛋白结合，大部分与红细胞结合，所以测定时需用全血［3］。

国内外文献［4～9］中分别采用UPLC－MS/MS、HPLC－/MS/MS、HPLC法、酶联免疫法等方法测定全血中西罗莫司的浓度。本实验采用UPLC－MS/MS检测beagle犬体内西罗莫司血药浓度，与其他方法比较，UPLC－MS/MS具有更高的分离效率和更快的分离速度，尤其与质谱联用后更能显示其优越的性能，由于不需要组分完全分离，大大缩短了保留时间，且灵敏度提高数倍。

本实验分别采用沉淀蛋白法(PPT)、液液萃取法(LLE)及固液萃取法(SPE)3种方法处理样本，并进行了对比，结果发现:使用PPT方法，快速简便，但内源性物质不能完全分离，不利于仪器的保护;LLE法采用乙醚作为萃取溶剂时，提取回收率约有76%，而SPE方法82%，会稍高一些，重复性亦好于LLE法。但采用SPE法时，发现因为血样组成复杂，重复使用SPE小柱，使提取效率明显下降，故要有满意的效果，不能再生使用，考虑到本实验的样品数量多，选用LLE方法能有效降低实验成本。因此最终选定LLE法做为血样萃取方法。

本实验中所建立的UPLC－MS/MS方法具有样品处理简单，方法灵敏、快速、选择性强，能满足西罗莫司在beagle犬体内药物检测的要求。

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