电针改善血管性痴呆大鼠学习记忆及其与海马神经细胞谷氨酸、NMDAR表达的关系

韦登明 贾学敏 尹向旭 蒋雯雯 (宁波大学医学院病理教研室，浙江 宁波 315211)

针刺治疗具有明显改善血管性痴呆(VD)患者的症状和体征、增强其学习记忆能力的作用〔1〕，但具体的分子生物学机制还不十分清楚。已有实验发现，学习和记忆的神经生物学基础是突触可塑性〔2〕，后者的理想模型是高频刺激引起的长时程增强效应(LTP)，而谷氨酸激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)是诱导LTP产生的前提条件〔3〕。我们以往的研究表明〔4〕，电针大鼠百会、大椎穴能改善VD大鼠学习记忆能力，其机制可能与促进海马LTP和增强海马突触可塑性有关。但电针改善VD大鼠学习记忆能力与海马谷氨酸及其NMDA受体表达的关系如何?尚未见报道，本实验在建立大鼠VD模型基础上，通过检测分析电针干预VD大鼠时对海马谷氨酸及其NMDA受体表达变化影响，旨在探讨电针对VD大鼠学习记忆影响的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SD大鼠40只，购于浙江大学医学院实验动物中心提供，合格证号0102008。雌、雄不限，体重200～250 g，自由饮食。大鼠适应性喂养7 d后，分为正常对照组、假手术组、模型组、电针组，每组10只。

1.2 试剂仪器 G6805电针仪(上海华谊仪器制造厂生产);Morris水迷宫(北京新天地科技公司生产);兔抗大鼠谷氨酸、NMDA受体多克隆抗体、生物素化羊抗兔 IgG、SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);RY-2000瑞医病理图文分析系统(东南大学瑞医科技产品)。

1.3 模型制备 模型组、电针组采用王蕊等〔5〕推荐的方法造模，将大鼠用10%的水合氯醛(3 ml/kg体重)麻醉后，仰卧位固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉;腹腔注射硝普钠(3.5 mg/kg体重)后，随即用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉，夹闭10 min再通10 min，再夹闭10 min，再通后缝合伤口，放回笼中保温饲养。假手术组麻醉及手术过程同上，但不阻断颈总动脉及注射硝普钠。

1.4 电针干预方法 电针组大鼠术后第7天，手术切口基本愈合，饮食正常，开始给予电针治疗。参照实验针灸学〔6〕中大鼠的穴位定位方法取百会、大椎穴进针，用28号30 mm长毫针，于大鼠头部百会穴(顶骨正中)斜刺1.5 mm，大椎穴(第7颈椎与第1胸椎间，背部正中)直刺1.5 mm，连接电针仪，采用连续波，频率为50 Hz，强度以大鼠能耐受为度(约1 mA)，每天电针1次，留针20 min，连续治疗10 d。

1.5 检测方法

1.5.1 学习记忆行为学检测 采用Morris水迷宫试验，于电针治疗结束时(即实验第17天)进行检测。①定位航行试验:历时6 d，每天2次，将大鼠固定从第一象限面向池壁放入水中，记录其2 min内寻找平台的时间，即逃避潜伏期(escape latency，EL)。逃避潜伏期越短提示大鼠学习记忆能力越强，反之则越差。②空间探索试验:定位航行试验结束后(即实验第22天)撤除平台，将大鼠固定从第一象限放入水中，测其2 min内跨越原平台的次数及其在水迷宫外环停留时间。大鼠在相同时间内跨越原平台的次数越多，学习记忆能力越强，反之则越差。由配套电脑系统自动记录成绩。

1.5.2 脑组织Glu、NMDA受体免疫组织化学染色观察 电针治疗结束后，用10%水合氯醛(3 ml/kg体重)麻醉大鼠，迅速开胸暴露心脏;经升主动脉插管后，先用100 ml生理盐水快速冲洗，随后用4%多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)灌注约1 h;灌注完毕后取海马脑组织，用甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋切片后行谷氨酸、NMDA受体免疫组织化学染色。

免疫组织化学染色主要步骤为:石蜡切片常规脱蜡至水，滴加0.3%H2O2在37℃下处理15 min;滴加10%正常羊血清在37℃下处理10 min，勿洗;滴加兔抗大鼠谷氨酸、NMDA受体多克隆抗体(1∶300、1∶400)在4℃下处理24 h;滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶100)在37℃下处理2 h;滴加SABC适量，在37℃下处理1 h;DAB显色5～10 min;阴性对照实验用磷酸盐缓冲液代替一抗，其余步骤相同。每步之间用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.4)洗3次，每次5 min。常规脱水、透明、封片。结果判断:显微镜下海马神经细胞胞浆呈棕色着色者为阳性细胞，用RY-2000瑞医病理图文分析系统进行计算其积分光密度。

2 结果

2.1 电针对大鼠空间学习记忆的影响 正常对照组、假手术组、电针组大鼠6 d平均逃避潜伏期明显短于模型组(P＜0.01)，而正常对照组、假手术组和电针组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。正常对照组、假手术组、电针组大鼠在平台象限跨越次数明显多于模型组(P＜0.01)，而电针组、正常对照组、假手术组3组之间比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。表明未给予治疗的模型大鼠学习记忆获取能力较差，而电针治疗则可改善模型大鼠的学习记忆能力。见表1。

2.2 电针对大鼠脑组织谷氨酸、NMDA受体表达的影响 正常对照组、假手术组大鼠海马组织见少量谷氨酸、NMDA受体阳性细胞;模型组大鼠脑组织见很少谷氨酸、NMDA受体免疫染色阳性细胞，主要分布海马神经细胞胞浆;应用电针治疗后，大鼠脑组织谷氨酸、NMDA受体免疫染色阳性细胞积分光密度值较模型组明显增加，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表1 大鼠水迷宫学习记忆行为学检测结果(±s，n=10)

表1 大鼠水迷宫学习记忆行为学检测结果(±s，n=10)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01

组别 逃避潜伏期(s) 平台跨越次数(次)正常对照组33±4.96 7.13±1.06假手术组 34±5.65 6.95±1.18模型组 78±6.421) 1.52±1.371)电针组 41±4.362) 5.68±1.642)

表2 电针对大鼠脑海马组织谷氨酸、NMDA受体表达的影响(±s，n=10)

表2 电针对大鼠脑海马组织谷氨酸、NMDA受体表达的影响(±s，n=10)

与假手术组组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

受体积分光密度正常对照组组别 谷氨酸积分光密度 NMDA 61.2±3.4 47.4±2.9假手术组 56.4±4.2 45.3±3.6模型组 37.3±4.11) 28.2±3.91)电针组 52.7±4.72) 41.5±4.52)

3 讨论

VD常由缺血性脑血管疾病引起。脑缺血易导致海马发生损伤，海马是学习和记忆的中枢，因此，VD表现为高级神经认知功能障碍为主的一组临床综合征。针刺治疗血管性痴呆具有多通道、多靶点、多水平的调节和控制作用，电针作为一种传统的非药物治疗手段，多年来在我国得到广泛应用，而且在临床老年性痴呆治疗中有肯定的价值〔1，7～10〕。中医学认为，VD病变在脑，督脉通于脑，百会、大椎皆属督脉，百会为“三阳五会”，大椎为“诸阳之会”，针刺两穴，可醒脑益智开窍、振奋阳气，并达阳以生阴之功，可促进VD大鼠脑组织功能恢复〔8〕，故本实验选穴以督脉之百会、大椎为治疗穴。结果提示电针百会、大椎穴可改善VD大鼠学习记忆能力。

谷氨酸是中枢神经系统内的主要兴奋性神经递质，约50%的谷氨酸参与调节中枢神经系统内的突触传递，几乎可调节正常脑内的所有功能，包括学习、记忆、运动、认知和发育。海马结构是学习记忆的重要区域，其神经元后膜有NMDAR，是兴奋性氨基酸谷氨酸的一类特异性受体。谷氨酸受体可分为代谢型和离子型两大类，离子型受体NMDAR被认为是突触可塑性及皮质和海马神经元LTP的主要调控者，构成了中枢神经系统的重要功能如学习和记忆的基础。有研究证明:选择性敲除小鼠海马CA 1区锥体细胞的NR 1亚单位后，其NMDAR诱导的LTP被破坏，且小鼠表现为空间记忆障碍〔11〕。

本研究提示学习记忆能力下降可能与谷氨酸、NMDA受体表达减少致神经传递功能障碍有关。关于VD大鼠海马神经谷氨酸、NMDA受体表达减少，我们推测可能与下列因素有关:在急性脑缺血缺氧等病理情况下，海马结构等缺血易损区的谷氨酸大量释放，激活了NMDAR，导致由NMDAR介导的Ca2+大量内流，Ca2+超载引发一系列的毒性反应，造成神经元损伤、脱失〔12〕，由于急性脑缺血时谷氨酸的过度释放和耗竭，使其与NMDA受体的结合减少或NMDA受体失活;同时由于海马神经元的数目减少和结构受损，导致NMDA受体数目减少。由于LTP的产生有赖于谷氨酸与其NMDA受体的结合〔3〕，海马神经谷氨酸、NMDA受体表达减少，必然造成LTP损害，引起神经传导功能障碍。电针治疗后，电针组大鼠与模型组比较，谷氨酸、NMDA受体免疫阳性细胞积分光密度值显著增大，提示电针大鼠百会、大椎穴可提高海马神经谷氨酸、NMDA受体的表达。

我们已有的研究表明〔4〕;电针VD大鼠百会、大椎穴可提高海马神经突触密度，促进突触结构的可塑性;并可促进海马神经LTP，加快海马神经元突触传递过程。因此，结合本实验结果，我们认为电针改善VD大鼠学习记忆能力的机制可能由于提高了海马神经突触密度，增加了海马神经突触的谷氨酸、NMDA受体表达的数量，从而促进促进海马LTP来实现的。具体机制有待进一步研究加以证实。

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