稳定表达水通道蛋白-4细胞株的建立及应用价值

张卫华 高 峰 (郑州市中牟县人民医院检验科，河南 郑州 45450)

视神经脊髓炎(NMO)是一种自身免疫性疾病〔1〕，患者血清中存在特异性自身免疫性抗体NMO-IgG〔2〕，该抗体能够与水通道蛋白-4(AQP4)特异性结合，目前对该特异性抗体的检测已被纳入 NMO诊断标准〔3〕。本研究拟通过构建稳定表达AQP4抗原的HEK293细胞株，建立以其为底物的间接免疫荧光方法，检测NMO患者血清中抗AQP4抗体，并与酶联免疫吸附(ELISA)法进行比较，为NMO的血清学诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康成年Balb/c小鼠由河南省动物实验中心提供。菌株 DH5α及HEK293细胞株购自Gibco公司，质粒pcDNA3.1为本室保存。血清标本取自郑州大学第一、二附属医院和河南省人民医院神经内科及眼科2010年1～10月住院患者，其中按照Wingerchuk等制定的NMO诊断标准(2006年修订版本)临床确诊NMO患者15例(男4例，女11例，平均41岁)，按照McDonald2005年诊断标准临床确诊典型多发性硬化患者36例(男21例，女15例，平均34岁)，其他神经内科及眼科病例30例(男14例，女16例，平均45岁)。对照血清标本由本室提供，均为英国RSR公司AQP4抗体ELISA检测试剂盒重复检测3次后，确定的AQP4抗体阳性和阴性血清。

1.2 主要试剂 限制性内切酶EcoRI、NotI、T4DNA连接酶和RT-PCR试剂为TakaRa公司产品，质粒提取试剂盒为Vegen公司产品，RPMI1640为Gibco产品，Trizol及LipofectamineTM2000购自Invitrogen，兔抗AQP4多克隆抗体、FITC标记的山羊抗兔及山羊抗人IgG购自北京中杉金桥公司，AQP4自身抗体ELISA检测试剂盒购自RSR公司。

1.3 AQP4基因的获取 无菌状态下取健康成年小鼠脑皮质，用Trizol试剂提取总RNA，并采用随机引物将RNA逆转录成cDNA，参照Genebank公布的AQP4序列(U14007)进行引物设计:上 游 引 物:5'-TATCGAATTCATGAGTGACGGAGCTGCAGCGAGGCGGTGG-3';下游引物:5'-TATGCGGCCGCTCATACAGAAGATAATACCTCT-3'。上、下游引物分别含有 EcoRI和NotI酶切位点，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。电泳鉴定RT-PCR扩增结果。

1.4 重组质粒的构建 用限制性内切酶EcoRI和NotI分别对RT-PCR产物及载体质粒pcDNA3.1进行双酶切，37℃条件下作用1 h。将酶切片段用T4 DNA连接酶16℃连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，接种到氨苄西林抗性LB平板培养过夜，次日挑取单克隆，扩大培养。碱裂解法抽提质粒，双酶切鉴定重组质粒。

1.5 细胞转染及稳定细胞株的建立 将2×105个HEK293细胞接种至6孔培养板，37℃ 5%CO2条件下培养至细胞融合达80% ～90%，然后按照LipofectamineTM2000的说明书进行质粒转染。同时转染空质粒pcDNA3.1作为对照组。37℃ 5%CO2条件下培养24 h后更换培养液并加入终浓度为800 μg/ml G418筛选。14 d后，挑取抗药性克隆至24孔培养板，同时G418降至维持浓度400 μg/ml，以获取稳定转染的细胞株。

1.6 RT-PCR检测AQP4在HEK293细胞中的表达 取筛选后的稳定细胞株采用Trizol试剂分别提取实验组和空质粒对照组总RNA，然后以RT-PCR检测细胞中AQP4的表达情况。

1.7 间接免疫荧光法检测转染细胞中AQP4的表达 将转染重组质粒后筛选得到的HEK293细胞及转染空质粒的HEK293细胞分别接种到6孔细胞培养板，孔中加有预先经多聚赖氨酸包被的盖玻片。37℃ 5%CO2进行培养，当细胞融合达50% ～70%时，取出盖玻片用4%多聚甲醛室温固定15 min，0.1%TritonX-100作用10 min，然后3%H2O2室温作用5 min以消除内源性过氧化物酶活性。用3%牛血清白蛋白室温封闭1 h，倾除血清，在标本上滴加1∶50稀释的兔抗AQP4多克隆抗体，室温孵育2 h，pH7.4 PBS冲洗，5 min×3次，滴加 1∶100稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG，荧光显微镜下进行观察，选用蓝色激发光，阳性细胞显示绿色荧光。

1.8 检测抗AQP4抗体的两种方法比较 ①间接免疫荧光法:按上述方法，在4%多聚甲醛室温固定的HEK293细胞株上滴加1∶50稀释后的患者血清，室温孵育2 h，pH7.4 PBS冲洗3次，滴加1∶100稀释的FITC标记山羊抗人IgG，室温反应1 h，pH7.4 PBS冲洗3次，荧光显微镜进行观察照相。②ELISA:按操作说明书进行。分别将25 μl血清标本加入预先包被有AQP4抗原的酶标孔中，同时设立阳性、阴性及空白对照。加入25 μl酶标二抗室温振荡孵育2 h，洗涤3次后加入100 μl底物SA-POD，室温震荡孵育20 min，再次洗涤3次后加入100 μl显色剂TMB于暗处室温静置20 min，加入100 μl终止液震荡5 s终止反应，阳性标本显示黄色。

2 结果

2.1 AQP4基因的克隆 小鼠小脑皮质总RNA的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳显示在993 bp处出现目的条带，条带清晰且无杂带(图1)。

图1 小鼠小脑皮质总RNA RT-PCR产物

2.2 重组质粒鉴定 pcDNA3.1-AQP4经EcoRI和NotI双酶切得到5 428和993 bp两个DNA片段，其中993 bp片段为与预期理论值相符的AQP4基因片段(图2)。

2.3 RT-PCR检测AQP4在HEK293细胞中的表达 转染重组质粒的细胞组扩增出一条约993 bp的条带，与理论值相符合，而转染空质粒组无目的条带的出现(图3)。

2.4 间接免疫荧光法检测转染细胞中AQP4的表达情况 转染重组质粒的细胞，抗原抗体反应后荧光显微镜下观察，细胞表面呈绿色荧光，而转染空质粒组细胞无荧光表达(图4)。

2.5 NMO患者血清AQP4抗体检测结果 ELISA法检测15例NMO患者血清AQP4抗体均为阳性，其他病例均为阴性。而以本实验建立的稳定细胞株为底物，用IFA法检测发现，15例NMO血清中有14例呈阳性反应，其他除眼病和脑血管病患者血清各有1例呈阳性反应外，其余均为阴性。以ELISA检测方法作为标准诊断法，IFA法的敏感性为93.3%(14/15)，特异性为97.4%(74/76)，正确指数为90.7%，假阳性率为3.0%，一致性为96.3%。

图2 重组质粒pcDNA3.1-AQP4酶切鉴定结果

图4 间接免疫荧光检测AQP4的表达(×200)

3 讨论

NMO患者体内特异性NMO-IgG是能与AQP4结合的高亲和性和高特异性IgG抗体，两者结合影响了AQP4的正常功能，并且所形成的免疫复合物通过激活补体而导致炎性脱髓鞘、硬化、坏死及血管的透明样变性〔4〕，从而引发NMO。目前对NMO的诊断主要依靠临床表现及头颅、脊髓磁共振成像(MRI)的影像学指标。但该病临床表现复杂，且易与多发性硬化相混淆，临床医生较难依据症状准确进行诊断。虽然MRI在NMO的诊断上具有特异性，但早期不易确诊，需注意动态观察，不能一次检查而定诊。NMO患者体内特异性NMO-IgG抗体的发现，为该病的诊断提供了新的方法〔3，5〕。由于NMO-IgG具有高度特异性，可用于鉴别NMO和多发性硬化〔6〕，且在疾病初期即可通过免疫学方法检测到，从而有效减少了误诊和漏诊，保证了早诊早治，使病人预后大大改善。因此获取AQP4抗原是进行NMO-IgG抗体检测的关键步骤。本研究选择小鼠作为AQP4基因来源由于取材于动物，且鼠类与人类之间AQP4抗原的差别不会影响该抗原与NMO病人NMO-IgG抗体结合〔7〕。

将目的基因导入细胞获得稳定表达的细胞株是本实验的重要环节，而选择高效、稳定的转染载体则是重要的前提。本实验选择质粒pcDNA3.1作为载体，除了该载体是真核表达载体、具有较为稳定的转染效果，而且还由于该载体含有抗新霉素(NeoR)标记基因，可以通过试剂G418来筛选稳定转染的细胞，未被转染的细胞则无法存活。本实验表明真核表达载体pcDNA3.1-AQP4构建成功。所建立的稳定表达 AQP4的HEK293细胞在NMO的临床诊断中具有良好的应用前景。

1 Misu T，Fujihara K，Kakita A，et al.Loss of aquaporin 4 in lesions of neuromyelitis optica:distinction from multiple sclerosis〔J〕.Brain，2007;130(Pt 5):1224-34.

2 Lennon VA，Kryzer TJ，Pittock SJ，et al.IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel〔J〕.J Exp Med 2005;202:473-7.

3 Wingerchuk DM，Lennon VA，Pittock SJ，et al.Revised diagnostic criteria for neuromyelitis optica〔J〕.Neurology，2006;66(10):1485-9.

4 Kinoshita M，Nakatsuji Y，Moriya M，et al.Astrocytic necrosis is induced by anti-aquaporin-4 antibody-positive serum〔J〕.Neuroreport，2009;20(5):508-12.

5 Petzold A，Pittock S，Lennon V，et al.Neuromyelitis optica-IgG(aquaporin-4)autoantibodies in immune mediated optic neuritis〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2010;81(1):109-11.

6 Marignier R，De Sèze J，Vukusic S，et al.NMO-IgG and Devic's neuromyelitis optica:a French experience〔J〕.Mult Scler，2008;14(4):440-5.

7 Bradl M，Misu T，Takahashi T，et al.Neuromyelitis optica:pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo〔J〕.Ann Neurol，2009;66(5):630-43.