甲珠对肝纤维化大鼠肝组织α-SMA表达的影响

付德才 张炜婷 樊丽萍 孙钰玮 (牡丹江医学院红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

肝状细胞(HSC)的活化是肝纤维化的中心环节，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是HSC是否激活的重要标志物，α-SMA的存在表明肝纤维化时HSC是激活的HSC，能合成大量ECM，是肝纤维化主要的来源细胞。中医方药对肝纤维化有很好的治疗效果，并已展示良好的应用前景〔1，2〕。甲珠为穿山甲的鳞片，主归肝经，具有软坚、通络、散结的功效，是历代医家治疗癥、瘕、集、聚的常用药，近年来被广泛用于治疗肝硬化，取得了较好的临床效果。但目前国内外尚无甲珠抗肝纤维化的基础及临床研究。本实验采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纤维化模型，观察甲珠对实验大鼠肝细胞损害及肝纤维化发生的防治作用，探讨甲珠保护肝组织及抗肝纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及药物 雄性22月龄Wistar大鼠108只，体质量(180±30)g，由吉林大学实验动物中心提供。甲珠(牡丹江中医院提供)研细末，高剂量组为2.0 g/kg(体质量)，中剂量组为1.0 g/kg(体质量)，低剂量组为0.5 g/kg(体质量)。

1.1.2 药品及试剂 CCl4购自北京北化精细化学品有限责任公司;秋水仙碱(colchicine)购自昆明股份制药有限公司;单克隆即用型鼠抗人α-SMA购自北京中山生物试剂公司。Trizol购于DingGuo公司，DEPC购于 Sigma公司，dNTPs购于日本Takara，PCR引物购于上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 参照文献〔3〕方法，实验第1天除正常对照组(简称对照组)外，其余动物予CCl4分析纯5 ml/kg体重，以后每隔3 d注射400 ml/L CCl4橄榄油剂3 ml/kg体重，连续8 w，实验前2 w饲喂高脂玉米粉饲料(795 g/kg玉米粉 +200 g/kg猪油 +5 g/kg胆固醇)，第 3～6周饲喂玉米粉1 000 g/kg和乙醇饮料300 ml/L。

1.2.2 分组及给药方法 采用成组设计，将108只大鼠随机分为6组，每组18只，第1组正常对照组，饲喂正常饮食;第2组模型组，按上述造模方法给予饮食;第3组秋水仙碱组，于造模第3周开始给予秋水仙碱0.1 mg·kg－1·d－1;第4组甲珠高剂量组，于造模第3周开始给予甲珠混悬液灌胃，2.0 g·kg－1·d－1;第5组甲珠中剂量组，于造模第3周开始给予甲珠混悬液灌胃，1.0 g·kg－1·d－1;第6组甲珠高剂量组于造模第3周开始，给予甲珠混悬液灌胃，0.5 g·kg－1·d－1，共8 w，造模结束时模型组死亡3只，中剂量组死亡3只，低剂量组死亡2只，秋水仙碱组死亡2只，高剂量组死亡1只，为增加可比性，每组均采用15只。

1.2.3 标本制作 上述造模及处理过程结束日，禁食12 h后称质量，股静脉取血，分离血清置－20℃保存;并立刻完整摘取肝脏及脾脏，称质量后用生理盐水漂洗肝左叶数次，滤纸拭干后，切取0.2 g置于冰浴中的组织匀浆器内，加入冰生理盐水2 ml，制备成100 g/L肝组织匀浆，4 000 r/min 4℃离心，取上清液保存于－20℃。肝右叶置于40 g/L中性甲醛液中常规固定，石蜡包埋，用于制作组织芯片。

1.3 检测指标

1.3.1 病理检测 组织芯片分别行常规HE染色、Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，根据王泰龄等改进的肝纤维化半定量评分系统(SSS)〔4〕进行炎症活动度及肝纤维化程度计分。

1.3.2 免疫组化SP法检测肝组织α-SMA含量 取肝左叶放入10%中性磷酸甲醛液中固定，取肝左叶最大横截面石蜡包埋切片，进行α-SMA免疫组织化学染色。免疫组织化学染色步骤:石蜡切片脱蜡、水化后，PBS冲洗3次，每次3 min;对组织进行微波修复;PBS冲洗3次，每次3 min;加试剂A过氧化酶阻断溶液，阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min;PBS冲洗3次，每次3 min;加试剂B正常山羊血清封闭，室温下孵育10 min;甩去血清，加相应的一抗1∶100稀释，4℃过夜;PBS冲洗3次，每次3 min;加试剂C生物素标记的第二抗体1∶60稀释，室温下孵育25 min;PBS冲洗3次，每次3 min:加试剂D链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育25 min;PBS冲洗3次，每次3 min;加新鲜配制的二氨基联苯二胺盐酸盐(DAB)溶液显色;自来水冲洗，苏木素复染，分化返蓝，切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

在全自动图像分析系统上，采用HPIAS-2000型图像分析软件进行定量分析，随机选取每张切片10个视野(×200)测定阳性细胞的灰度值与所占视野面积，灰度值在0～249之间，灰度值越高，染色越浅，表达产物越少;灰度值越低，染色越深，表达产物越多。

1.3.3 RT-PCR法检测肝组织α-SMA mRNA 大鼠GAPDH上游引物:5'-CATGGTCTACACGTTCCAGT-3'，下游引物:5'-CATTGAGAGCAATGCCAGCT-3'，全长 785 bp;TGFβ1上游引物:5'-ACTACTGCTTCAGCTCCACA-3'，下游引物:5'-ATCATGTTGGACAACTGCTC-3'，全长 301 bp;α-SMA 上游引物:5'-TGTGCTGGACTCTGGAGATG-3'，下游引物:5'-CTTCTGCATCCTGTCAGCAA-3'，全长 493 bp。

大鼠肝组织总RNA的提取按Trizol试剂盒操作说明进行。①从液氮罐中取出100 mg肝组织放入冰浴的研磨器内，加入1 ml Trizol，使用电动匀浆机充分研磨，直到液体不再黏稠;②将裂解物移到2 ml离心管内，室温放置5～10 min;③加入0.2 ml氯仿，震荡混匀 15 s，室温放置10 min;④12 000 r/min，4℃离心10 min;⑤取上层水相，加0.5 ml异丙醇混匀，室温放置10 min;⑥12 000 r/min，4℃离心10 min;⑦弃上清，加 1 ml 75%乙醇，不要混匀，7 500 r/min，4℃离心5 min;⑧弃上清，室温晾干5～10 min，不要完全干燥;⑨用10 μl/1 000 DEPC处理水溶解;⑩取2 μl稀释后在紫外分光光度计上测浓度。

在紫外分光光度计上测定核酸260 nm和280 nm的吸收值，判断RNA质量和浓度。如OD260/OD280＞1.8，证明纯度较高。核酸浓度的计算:RNA的浓度(μg/ml)=40×稀释倍数×OD260值。

1.3.4 RT-PCR 肝组织总RNA经紫外分光光度计测量，每个样本取5 μg RNA在 AMV逆转录酶作用下合成 cDNA，即42℃水浴60 min，95℃水浴5 min灭活AMV。PCR反应体系为100 μl，反应条件:94℃变性30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，扩增30个循环;72℃延伸10min，同法扩增GAPDH作为内参照。取5 μl PCR产物150 ml/L琼脂糖凝胶电泳 30 min(100 V)，用图像分析仪扫描底片上PCR产物带，以内参GAPDH为基准，作半定量，即以目的基因扩增量/GAPDH扩增量表示所扩增目的基因片段的相对表达水平。

2 结果

2.1 免疫组化结果 α-SMA在胞质表达，正常对照组只表达于小动脉及小静脉，在胆管无表达。模型组α-SMA主要表达于汇管区及纤维间隔，且呈长椭圆形或梭形。模型组α-SMA免疫组织化学染色灰度值明显降低，表达产物增加，阳性染色程度增加，显著高于正常组(P＜0.01)。实验表明不同剂量甲珠与秋水仙碱灌胃防治后，较模型组α-SMA灰度值升高，表达产物减少，阳性染色程度不同程度减轻(P＜0.01);模型组α-SMA免疫组织化学染色阳性面积明显升高，显著高于正常对照组(P＜0.01)。甲珠治疗各组及秋水仙碱干预组染色阳性面积明显低于模型组(P＜0.01)。见表1。

2.2 RT-PCR结果 正常肝组织不表达α-SMA mRNA，模型组较正常对照组明显增强;不同剂量甲珠(2.0、1.0、0.5 g/kg)与秋水仙碱(0.1 mg/kg)灌胃组α-SMA mRNA表达明显减少，与模型组比较差异显著(P＜0.01，P＜0.05)。见表2，图1。

2.3 大鼠肝组织病理变化

2.3.1 HE染色 正常对照组大鼠肝细胞排列整齐，肝小叶结构完整、清晰，肝细胞大小、形态一致。模型组大鼠肝细胞肿胀，肝细胞弥漫性水样变性和脂肪变性，肝窦及中央静脉明显扩张，肝索排列紊乱，门管区及肝小叶内可见明显的灶性淋巴细胞浸润，可见间质细胞大量弥漫性增生，分隔包绕肝细胞，部分区域形成细胞纤维间隔，或纤维细胞间隔，纤维组织增生明显，将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团，假小叶形成。甲珠干预各组肝细胞有不同程度的变性坏死，汇管区及小叶间有少量纤维组织增生，纤维间隔细小，肝细胞索排列较整齐，肝小叶结构基本完整，间质有少量炎性细胞浸润，但较模型组减轻，与模型组比较纤维化程度差异显著。秋水仙碱干预组肝细胞有不同程度的变性坏死，汇管区及小叶间有少量纤维组织增生，肝细胞内可见脂肪沉积。

表1 各组大鼠肝组织α-SMA的染色灰度值及染色阳性面积(n=15，)

表1 各组大鼠肝组织α-SMA的染色灰度值及染色阳性面积(n=15，)

与正常对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01

组别 α-SMA灰度值 α-SMA阳性面积(%)正常对照组14.23±1.41 116.44±12.60 1.48 ±0.24模型组 79.518±9.811) 16.32±1.751)秋水仙碱组 103.74±17.692) 9.45±1.27甲珠高剂量组 109.18±17.542) 9.21±1.29甲珠中剂量组 100.7±13.092) 12.63±1.44甲珠低剂量组 98.70±9.792)

表2 各组大鼠肝组织α-SMA mRNA/GAPDH mRNA比较(n=15，，%)

表2 各组大鼠肝组织α-SMA mRNA/GAPDH mRNA比较(n=15，，%)

与正常对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05

-SMAmRNA/GAPDH正常对照组组别 α 14.23±1.57 1.48±0.24模型组 16.32±2.141)秋水仙碱组 9.46±1.202)甲珠高剂量组 9.21±1.122)甲珠中剂量组 12.63±2.422)甲珠低剂量组

图1 肝纤维化大鼠肝组织α-SMA mRNA RT-PCR凝胶电泳结果

2.3.2 大鼠肝组织Masson三重胶原染色 Masson三重胶原染色可见:正常组大鼠肝小叶结构正常，肝索排列规则，小叶周边仅见少量胶原纤维呈绿色，染色较轻。模型组大鼠肝组织胶原纤维明显增生，沿汇管区或炎症坏死区向外延伸，形成厚薄不一的纤维间隔，分割包绕肝小叶，局部有假小叶形成。甲珠干预各组肝组织也有少量绿色的胶原纤维增生，主要分布于肝脏间质内，部分向肝小叶内伸展，且胶原纤维较纤细，部分区域可见胶原纤维沿炎症坏死区延伸，形成间断、薄的纤维间隔，无明显假小叶形成。秋水仙碱组介于治疗组和模型组之间。Masson胶原染色定量分析结果表明，模型组胶原显色指数明显高于正常对照组(P＜0.01)，甲珠高剂量组、中剂量组和秋水仙碱组胶原显色指数显著低于模型组(P＜0.01)，甲珠低剂量组胶原显色指数明显低于模型组(P＜0.05)。

3 讨论

Hyp是构成胶原纤维的特异氨基酸成分，肝组织Hyp的含量可较准确地反映肝组织胶原纤维含量。在肝纤维化实验研究中，常以此指标来反映胶原纤维增生的程度。本实验结果显示，CCl4诱发大鼠肝纤维化后肝组织Hyp显著升高，与正常组形成显著差异，说明胶原增生十分活跃，与以往报道结果相符。经甲珠各组治疗后其含量明显降低，其中高剂量组尤为明显。表明甲珠对实验性大鼠肝纤维化程度具有较好的防治作用。

研究表明脂质过氧化是肝纤维化发生途径中的重要环节之一。机体受到外界环境的氧化损伤后产生大量自由基攻击细胞膜导致脂质过氧化，使肝细胞损伤和坏死，最终导致肝纤维化的形成。在CCl4诱发的肝纤维化发生机制中，自由基的肝损伤作用尤为突出。氧自由基可促使不饱和脂肪自由基形成，脂质自由基可引起细胞膜的流动性、通透性和完整性的破坏，进而使其双层结构发生断裂，引起膜镶嵌的一系列酶的排列紊乱、功能丧失，细胞的能量产生系统瘫痪。MDA是脂质过氧化的最终产物，可严重破坏细胞膜的结构，导致细胞肿胀、坏死，其含量反映了组织过氧化的损伤程度〔5～8〕。SOD的变化可以间接地反映疾病情况下自由基的变化。SOD为高效的清道夫，可抑制自由基启动的脂质过氧化，从而起到保护细胞膜结构与功能完整的作用〔9〕。氧化应激和脂质过氧化是引起肝细胞损伤和HSCs活化的重要机制〔10〕，在肝纤维化的发生发展过程中有氧自由基的产生，随后的脂质过氧化产物(如MDA)可通过JUK通路激活HSCs I型胶原α2基因表达，进而促进肝纤维化的发生。在多种肝纤维化模型中均发现肝脏MDA含量升高及GSH水平降低〔11，12〕。甲珠治疗后能明显降低肝组织中Hyp、MDA含量，提高SOD的水平，从而增强肝脏清除自由基的能力，减少肝脏脂质过氧化损伤，进而减少ECM的形成，减轻肝细胞损伤，发挥其保护肝脏和抗肝纤维化的作用。

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