葛根素预处理对大鼠脑缺血早期脑组织eNOS的影响

2011-08-02谷翠芝李清初杨峻浩卢慧玲吴秋慧容明智黄岚珍冯飞玲

中国病理生理杂志 2011年9期

谷翠芝，李清初，谭宁，杨峻浩，卢慧玲，吴秋慧，容明智，黄岚珍，冯飞玲

(桂林医学院，广西桂林 541004)

脑血管疾病是当前导致人类死亡和残障的主要原因之一，而且其发病率呈现逐年增加的趋势，其中80%左右为缺血性脑血管疾病。研究发现，急性脑缺血后，如能在脑血管栓塞后3 h内(早期)，特别是在0.5 h(超早期)内使脑血流恢复将大大降低病人的死亡率和致残率[1]。脑血管内皮细胞产生的内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)合成一氧化氮(nitric oxide，NO)，能够扩张脑血管，特别是在缺血半阴影区(ischemic penumbra，IP)，增加脑血流量对缺血的脑组织产生保护作用[2]。葛根素(puerarin)是从葛根中提纯分离得到的8－β－D－葡萄吡喃糖－4＇，7－二羟基异黄酮，能够改善微循环，临床上常用于治疗心脑血管疾病，但其具体作用机制迄今仍未完全清楚。本研究采用多种实验方法，探讨葛根素对脑缺血早期的脑保护作用与脑组织eNOS表达的关系，为临床应用葛根素防治缺血性脑病提供参考依据。

材料和方法

1 材料

1.1 动物健康雄性Wistar大鼠45只，SPF级，体重(269±25)g，由桂林医学院动物中心提供。

1.2 药品和试剂注射用葛根素购于山东瑞阳制药有限公司;兔抗eNOS多克隆抗体、免疫组化(DAB显色)试剂购于武汉博士德生物技术公司。甲苯胺蓝、Western blotting所需试剂购于USB和Sigma。

1.3 仪器 Olympus倒置相差显微镜及摄像系统由日本生产，小型垂直板凝胶电泳仪和电转印迹仪美国生产，全自动凝胶成像分析仪购于上海培清科技有限公司。

2 方法

2.1 动物分组与模型制作大鼠随机分为假手术组(S组)、脑缺血组(M组)和葛根素预处理组(P组)。其中，P组和M组又分别分为脑缺血 0.5 h、1 h、2 h、4 h 4 个亚组，每组5 只。参照Longa等线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，用10%水合氯醛35 mg/kg ip麻醉，取颈前中线左旁0.2 cm处切口，用5号半静脉针头于颈总动脉(common carotid artery，CCA)刺一小口并插入线栓，插入深度为距CCA分叉处(19±1)mm，栓塞大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)。判断动物模型制作成功的标志之一是解剖大鼠时，在MCA起始部看见插入的线栓头。S组除不插线，其余步骤同模型组。每组均在手术前10 min ip给药，P组注射葛根素100 mg/kg，S组和M组注射等量生理盐水。所有大鼠饮自来水，饲普通鸡饲料，生活在昼夜节律为12 h、保持恒温、恒湿的饲养间。

2.2 神经功能缺损评分(5分法) 在脑缺血2 h和4 h，按照Longa 5分法评分标准，对各组大鼠进行神经功能缺损评分:0分:无神经功能缺损;1分:提尾时右前肢内收，不能完全伸展;2分:自发行走时向右侧转圈;3分:行走时身体向右侧倾倒;4分:不能自发行走;5分:有意识丧失。评1分及以上者定为造模成功。

2.3 神经尼氏体染色采用改良的甲苯胺蓝染色法。取近视交叉处石蜡块切片，常规脱蜡至水，置1%甲苯胺蓝水溶液(50－60℃)染色30 min，蒸馏水稍洗，95%乙醇分化约3 s，入酸化伊红约3s，95%乙醇分化约3s，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光镜下观察神经尼氏体变化。

2.4 免疫组化方法测定脑组织eNOS的表达和分布取近视交叉处石蜡块切片，用复合消化酶法进行抗原修复，滴加5%正常山羊血清封闭，用兔抗eNOS多克隆抗体(1∶50)孵育，DAB显色。每张切片随机选取5个位于脑皮层和海马区的不互相重复的高倍视野，通过Image－Pro Plus图像采集系统采图，并运用该图像处理软件计算每个视野的光密度，取其平均值，分析比较各组大鼠eNOS的平均吸光度(absorbance，A)值。

2.5 Western blotting测定脑组织eNOS蛋白表达 (1)蛋白提取:每组大鼠取脑组织前半部分切成小块，用蛋白裂解液裂解、匀浆、离心，取上清液用考马斯亮蓝测定蛋白质含量。(2)SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳:制备10%分离胶和5%浓缩胶，电泳电压100 V、30 min;当染料移行到浓缩胶底线呈一直线时，调整电压为200 V、100 min。(3)转膜:依次铺上海绵垫、4张滤纸、凝胶块、硝酸纤维素膜、4张滤纸和另一海绵垫，夹紧转印迹夹，接通电源，维持电压150 V、80 min。(4)蛋白、抗体封闭:5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，兔抗eNOS多克隆抗体(1∶100)室温下孵育1－2 h，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG稀释液(1∶500)室温下孵育1－2 h。(5)化学发光、显影、定影:根据信号的强弱适当调整曝光时间。胶片经扫描后，用凝胶图像分析系统对蛋白表达条带进行吸光度扫描，用条带吸光度与内参照(β－actin)条带吸光度的比值来表示eNOS蛋白表达水平。

3 统计学处理

采用SPSS 12.0统计软件包进行处理。神经功能缺损评分数据为等级资料，采用非参数检验中的多个独立样本等级资料的检验(Kruskal－Wallis检验)及多重比较。其它资料均为计量资料，以均数±标准差()表示，采用完全随机设计的方差分析(One－way ANOVA分析)，组间两两比较采用LSD－t法。检验水准α=0.05(two－tailed)。

结果

1 大鼠神经功能变化

手术后麻醉清醒，M 2 h、M 4 h组大鼠神经功能缺损表现明显重于P 2 h和P 4 h组，S组未出现神经功能缺损表现。组间比较，差异显著(P ＜0.01或 P ＜0.05)，见表1。

表1 葛根素预处理对大脑中动脉栓塞大鼠神经功能缺损评分的影响Table1.Effects of puerarin pretreatment on neurological deficit scores after MCAO in rats

2 大鼠神经元尼氏体变化

高倍镜下，S组锥体细胞呈多边形，突起明显，尼氏小体和细胞核清晰可见，核居中，呈空泡状，核仁淡蓝色，胞质见尼氏小体呈深蓝色斑块状，分布量多，见图1。M组随着脑缺血时间延长，可见尼氏小体出现溶解，数量逐渐减少，M 4 h组锥体细胞肿胀、出现空泡变性，尼氏小体呈线状、边集。P组各亚组锥体细胞形态正常，脑缺血2 h内神经元尼氏体未见明显溶解，脑缺血4 h细胞核周围出现尼氏小体溶解，但程度很轻，未见空泡变性。

3 免疫组织化学检测大鼠脑组织eNOS蛋白表达和分布的变化情况

染色结果显示，eNOS蛋白主要表达在大鼠脑组织血管内皮及中、小血管平滑肌细胞膜和细胞质中，部分神经细胞胞质中也有表达，阳性表达呈棕黄色或橙黄色。S组大鼠海马及皮质层微动脉和毛细血管内皮表达不明显。M组大鼠以M 1 h组eNOS表达增加明显(P＜0.05或P＜0.01)，以缺血区周围的皮质中、小血管内膜为主;P组大鼠eNOS表达均比对应时点的M组增强(P＜0.01)，以缺血区周围组织的血管为主。各组eNOS蛋白表达量见表2。

表2 葛根素预处理对脑缺血大鼠脑组织eNOS蛋白表达的影响Table2.Effects of puerarin pretreatment on eNOS protein expression in rat brain tissues injured by cerebral ischemia(.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs S group;##P ＜0.01 vs M groups at the same time points.

Group eNOS protein expression S 0.1589 ±0.0019 M 0.5 h 0.1683 ±0.0068 M 1 h 0.3375 ±0.0206＊＊M 2 h 0.3157 ±0.0446＊＊M 4 h 0.2744 ±0.0504*P 0.5 h 0.3737 ±0.0175##P 1 h 0.5240 ±0.0719##P 2 h 0.6682 ±0.0596##P 4 h 0.6512 ±0.0714##

Figure1.Neuron Nissl body staining(×640).A:sham－operated group;B1:cerebral ischemia 0.5 h group;B2:cerebral ischemia 1 h group;B3:cerebral ishemia 2 h group;B4 cerebral ischemia 4 h group;C1:puerarin pretreatment and cerebral ischemia 0.5 h group;C2:puerarin pretreatment and cerebral ischemia 1 h group;C3:puerarin pretreatment and cerebral ischemia 2 h group;C4:puerarin pretreatment and cerebral ischemia 4 h group.图1 神经元尼氏体染色

4 Western blotting方法检测大鼠脑组织eNOS蛋白表达变化情况

S组大鼠脑组织eNOS蛋白表达很少;M组中，以M 1 h组eNOS蛋白表达最高(P＜0.05)，而M 0.5 h组表达很少;P组eNOS蛋白表达均明显高于对应时点的M组(P＜0.05);各组eNOS表达结果见图2。

Figure2.Analysis of eNOS protein expression in brain tissues of rats in sham －operated group(S)，cerebral ischemia group(M)，puerarin pretreatment group(P).A:data from Western blotting for eNOS protein;B:relative expression of eNOS protein.＊＊P ＜0.01 vs S group;#P＜0.05，##P ＜ 0.01 vs M groups at the same time points.图2 假手术组、脑缺血组和葛根素预处理组大鼠脑组织eNOS蛋白质表达的比较

讨论

缺血性脑卒中又称为脑梗死，是各种原因导致的脑动脉血流中断，局部脑组织发生缺血缺氧性坏死而引发的相应神经功能缺损。由于脑组织的氧、葡萄糖和糖原储备甚微，血流一旦完全阻断，数分钟内即可出现能量代谢和离子平衡紊乱。因此，在有效防治缺血性脑损伤的研究中，人们很重视尽早改善脑血流供应。NO是脑内重要的信号分子，由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化精氨酸产生;低浓度的NO可活化可溶解性鸟苷酸环化酶，促进cGMP产生，使血管平滑肌细胞松弛，增加脑血流量，并抑制谷氨酸释放产生脑保护作用[3];高浓度的NO促进谷氨酸释放，并可与自由基作用产生毒性更强的ONOO－和·OH。NOS依据组织类型分为3种:eNOS、神经元型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)。nNOS和eNOS是Ca2+－钙调蛋白依赖性酶，在生理状态下就有表达;iNOS为非钙离子依赖性酶，正常情况下不表达，仅在脂多糖及许多细胞因子刺激下才表达。其中，nNOS和iNOS催化NO产生的作用强烈、持久，而eNOS的作用相对温和短暂[4]。在MCAO后，eNOS基因缺陷鼠脑IP的脑血流量较野生鼠减少，而缺血中心区的梗死范围更大，这表明eNOS基因表达在IP的血管扩张中起着关键作用[5]。

葛根素的脑保护作用已在临床应用中被证实，对它的脑保护作用机制也有许多研究。如实验发现葛根素可抑制脑缺血大鼠海马nNOS的表达[6];葛根素预处理可降低缺血再灌注大鼠脑组织的NO水平和细胞间黏附分子－1(intercellular adhesion molecule－1，ICAM －l)蛋白、mRNA 表达及核因子－ κB(nuclear factor－ κB，NF － κB)065 亚基核转位[7，8];羟乙葛根素可降低缺血再灌注大鼠脑组织的总NOS和iNOS活力[9];葛根素还能降低血管性痴呆大鼠海马的低氧诱导因子－1α和红细胞生成素的表达，这一结果间接证明了它可促进缺血脑组织的血流灌注、提高缺血区氧浓度[10];更有证据直接显示葛根素能增加脑及冠状动脉的血流量[11]。本实验中，P组大鼠脑组织eNOS表达均比M组明显增强(表2和图2)，大鼠神经功能缺损和海马锥体细胞损伤却明显轻于M组。最重要的是，在脑缺血0.5h，P组大鼠脑组织IP血管的eNOS表达明显增强，而且eNOS表达增强的持续时间延长;M组在此时段eNOS表达增加不明显。由此推测，葛根素预处理对大鼠脑缺血的脑保护作用与它在脑缺血后快速上调脑组织eNOS的表达有关。临床研究还发现，葛根素治疗能升高脑梗死患者血清中的血管内皮生长因子和NO水平，减轻脑梗死后延迟再损伤，缩小脑梗死体积，减轻脑水肿，改善神经功能[12]。

此外，eNOS还能抑制血管收缩反应和脑血管痉挛，能影响血脑屏障内皮组织的渗透性[13]。在卒中的小鼠试验中发现，eNOS能促进血管平滑肌增殖和迁移，增大脑血管的密度和直径，促进卒中后的脑侧支循环建立[14];eNOS缺陷可损害神经信号传导和卒中后的神经生长[15]。本研究显示葛根素可在脑缺血后的短时间内促进脑组织eNOS蛋白的表达，从多层面产生脑保护作用。

[1]郭国际，李淮玉，丁小灵，等.急危重症脑卒中[M].第1版.合肥:安徽科学技术出版社，2009.2－137.

[2]Kano T，Shimizu － Sasamata M，Huang PL，et al.Effects of nitric oxide synthase gene knockout on neurotransmitter release in vivo[J].Neuroscience，1998，86(3):695 －699.

[3]Czapski GA，Cakala M，Chalimoniuk M，et al.Role of nitric oxide in the brain during lipopolysaccharide－evoked systemic inflammation[J].J Neurosci Res，2007，85(8):1694－1703.

[4]孙凤艳.医学神经生物学[M].第1版.上海:上海科学技术出版社，2008.172 －173.

[5]Huang Z，Huang PL，Ma J，et al.Enlarged infarcts in endothelial nitric oxide synthase knockout mice are attenuated by nitro－L －arginine[J].J Cereb Blood Flow Metab，1996，16(5):981 －987.

[6]张茹，成红学，吴海琴，等.葛根素对大鼠局灶性缺血脑组织内海马神经元型一氧化氮合酶表达的影响[J].西安交通大学学报，2010，31(6):669－672.

[7]谭军，潘登，孙兆印.葛根素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中一氧化氮水平的影响[J].新乡医学院学报，2008，25(5):453－455.

[8]娄海燕，魏欣冰，王汝霞，等.葛根素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后炎症反应的抑制作用[J].中国病理生理杂志，2007，23(2):366 －369.

[9]王姿颖，魏欣冰，孙茹，等.羟乙葛根素对大鼠脑缺血再灌注损伤一氧化氮和一氧化氮合酶的影响[J].中国药学杂志，2006，41(2):112－114.

[10]吴海琴，张蓓，张桂莲，等.葛根素对血管性痴呆大鼠海马中低氧诱导因子－1α和红细胞生成素表达的影响[J].西安交通大学学报:医学版，2006，27(2):132 －136.

[11]Chen L，Chai Q，Zhao A，et al.Effect of puerarin on cerebral blood flow in dogs[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，1995，20(9):560 －562.

[12]高炳忠，周晋贤，黄开梅.葛根素葡萄糖对脑梗死患者血清血管内皮细胞生长因子和一氧化氮水平的临床研究[J].中华老年心脑血管病杂志，2004，6(2):137.

[13]Santhanam AV，Smith LA，Akiyama M，et al.Role of endothelial NO synthase phosphorylation in cerebrovascular protective effect of recombinant erythropoietin during subarachnoid hemorrhage－induced cerebral vasospasm[J].Stroke，2005，36(12):2731 －2737.

[14]Cui X，Chopp M，Zacharek A，et al.Role of endothelial nitric oxide synthetase in arteriogenesis after stroke in mice[J].Neuroscience，2009，159(2):744 －750.

[15]Chen J，Zacharek A，Zhang C，et al.Endothelial nitric oxide synthase regulates brain－derived neurotrophic factor expression and neurogenesis after stroke in mice[J].J Neurosci，2005，25(9):2366 －2375.