ERK通路和三七总皂苷干预在低氧高二氧化碳性肺动脉高压中的作用*

2011-08-02朱阿楠王园园王淑君金可可王万铁

中国病理生理杂志 2011年9期

朱阿楠，王园园，王淑君，金可可，汪洋，王万铁△

(1温州医学院病理生理学教研室，浙江温州 325035;2余姚市中医医院内科，浙江余姚 315400)

低氧高二氧化碳性肺动脉高压(hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)发展到肺心病的中心环节，HHPH的产生及严重程度明显影响着 COPD和肺心病的病程和预后。近年来的研究表明:MAPKs信号转导通路在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应的过程中具有至关重要的作用[1]，且肺动脉高压的发生可能与该通路的激活有关[2]。本文研究了ERK信号通路在大鼠低氧高二氧化碳性肺动脉高压发生发展中的动态变化，并探讨三七总皂苷(Panax notoginoside，PNS)防治低氧高二氧化碳性肺动脉高压的机制。

材料和方法

1 慢性低氧高二氧化碳肺动脉高压动物模型的复制

雄性 SD大鼠72只(体重200－220 g)，随机分成6组(n=12)，即正常组(N)、低氧3 d组(H3d)、1周组(H1w)、2周组(H2w)、4周组(H4w)和血塞通(成分为三七总皂苷)治疗组(Hp)。将后5组大鼠放入常压低氧高二氧化碳舱内，舱内氧气浓度维持在9% －11%，二氧化碳浓度维持在5% －6%(舱内水蒸汽用无水 CaCl2吸收，多余二氧化碳用氢氧化钙吸收)，每天8 h，每周6 d。Hp组于每天进舱前30 min腹腔注射血塞通注射液(50 mg·kg－1·d－1)，其余各组大鼠腹腔注射等量生理盐水。N组置于舱外，自由呼吸空气，其它组饲养条件相同。

2 模型建立

每组随机取10只大鼠。采用右心导管法自颈外静脉插管至肺动脉，并行颈总动脉插管，经Power-Lab生理记录仪分别测定平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)及平均颈动脉压(mean carotid arterial pressure，mCAP)。

放血处死动物，分别称取右室(right ventricle，RV)和左室加室间隔(left ventricle+septum，LV+S)的重量，并计算出RV/(LV+S)的重量比，作为右室肥大的指标。以mPAP、mCAP和RV/(LV+S)作为判断模型建立成功的指标。

3 肺细小血管显微结构观察

取肺组织，常规石蜡制片(厚度5 μm)，HE染色，显微镜观察并拍照。每只大鼠随机选1张肺组织切片，每张切片随机选直径50－200 μm肺细小动脉5支，用IPP5.0(Image－Pro Plus)彩色图像分析系统测定肺细小动脉管壁面积/管总面积(vessel wall area/total area，WA/TA)，管腔面积/管总面积(vessel cavity area/total area，EA/TA)。

4 肺细小动脉ERK的免疫组化检测及结果处理

肺组织石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O2室温处理 10 min，滴加Ⅰ抗(1∶100)，37 ℃孵育 1 h，再滴Ⅱ抗、SABC、3，3－二氨基苯联胺(DAB)显色，阳性结果呈棕黄色。随机选取直径50－200 μm的肺内动脉10条，采用IPP5.0(Image－Pro Plus)彩色图像分析系统测定阳性部位及背景的吸光度值，以阳性部位的吸光度值减背景的吸光度值代表阳性部位的吸光度(absorbance，A)值。

5 蛋白免疫印迹法检测肺组织中磷酸化ERK蛋白含量及图像处理

各组取肺组织100 mg，剪碎转移至玻璃匀浆器中，加入含1 mmol/L PMSF的裂解液1000 μL，匀浆以充分裂解肺组织。超声粉碎仪裂解细胞5 s×4次后，12000 r/min离心 5 min，吸取上清，分装，－80℃保存。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度:用蛋白标准品作出标准曲线，紫外分光光度计测定样品吸光度，根据标准曲线得出样品的蛋白浓度，调节蛋白浓度，上样量为40 μg。蛋白质电泳和印迹电转移:SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳配置质量分数为10%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳条件:恒压，先80 V，待溴酚蓝到达分离胶后改电压为130 V，直至溴酚蓝跑到凝胶底部;电泳结束后进行印迹转移，应用聚乙烯二氟(PVDF膜)380 mA恒流电转40 min，转移完毕后分别用立春红和考马斯亮兰染膜和胶。Western印迹分析:采用质量分数为5%BSA的TBST封闭液室温封闭1 h，TBST洗膜3次后，加入单克隆兔抗大鼠磷酸化 ERK或单克隆兔抗大鼠总ERK(总ERK为磷酸化ERK起校正内参的作用，浓度均为1∶1000稀释)，于4℃ 孵育过夜，第2 d加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶2000稀释)，室温置1 h;TBST洗膜3次，化学发光底物ECL显色、胶片曝光，用UVP凝胶成像扫描系统对胶片条带进行定量性密度测定，Quantity One软件计算其灰度值。

6 统计学处理

结果

1 各组大鼠mCAP、mPAP和RV/LV+S的比较

1.1 各组大鼠mCAP的比较 N组、H3d组、H1w组、H2w组、H4w组和 Hp组大鼠间 mCAP无明显差异(P＞0.05)，见表1。这说明低氧高二氧化碳对大鼠的体循环压没有影响。

1.2 各组大鼠 mPAP的比较与N组相比，H3d组mPAP无明显升高(P＞0.05)。随着低氧时间的延长，H1w组、H2w组、H4w组和 Hp组的 mPAP均高于 N组(均P＜0.05)，且各组之间差异明显(P＜0.05)。说明随着低氧时间的延长，大鼠mPAP1周时即开始明显升高，4周后达到较高水平。同时可见Hp组mPAP明显低于H4w组(P＜0.05)，见表1。这说明PNS可减轻低氧高二氧化碳大鼠的肺动脉高压。

表1 慢性低氧高二氧化碳及PNS对大鼠mPAP、mCAP和RV/LV+S的影响Table1.Effect of chronic hypoxia hypercapnia on mPAP，mCAP and RV/LV+S of rats(.n=10)

*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs H3dgroup;▲P＜0.05 vs H1wgroup;☆P ＜0.05 vs H2wgroup;★P ＜0.05 vs H4wgroup.

Group mPAP(mmHg) mCAP(mmHg) RV/LV+S(%)N 11.00 ±0.62 107.46 ±6.40 23.41 ±0.97 H3d 11.84 ±0.49 110.13 ±5.44 24.29 ±1.02 H1w 13.54 ±0.65＊△ 109.19 ±4.99 24.76 ±1.04 H2w 16.85 ±0.88﹡△▲ 108.03 ±4.92 30.19 ±0.95*H4w 23.12 ±0.53＊△▲☆ 114.85 ±9.87 36.04 ±0.65＊△▲Hp 18.74 ±0.74＊△▲☆★ 106.32 ±6.34 31.57 ±0.69＊△▲★

1.3 各组大鼠RV/LV+S的比较随着低氧时间的延长，H2w、H4w和Hp组的RV/LV+S均高于 N 组(均P＜0.05)，但H3d组、H1w组的RV/LV+S较N组增加不明显(均P＞0.05)。这说明随着低氧时间的延长，大鼠2周后RV/LV+S即开始明显升高，而且逐渐增加，第4周达较高水平。同时可见Hp组RV/LV+S明显低于H4w组(P＜0.05)，见表1。这说明PNS可减轻低氧高二氧化碳大鼠的右心室肥厚。

2 光镜下各组大鼠肺细小动脉结构的比较

光镜下所见，N组，平滑肌层未见明显增生，管壁均匀一致，而随着缺氧间期的延长，H1w组、H2w组、H4w组和Hp组内弹力板扭曲明显，中膜平滑肌细胞增生，管腔明显狭窄，但H3d组改变不明显，见图1A－F。Hp组与H4w组比较，其血管壁的改变明显减轻，见图1E －F。随着低氧时间的延长，H1w、H2w、H4w和 Hp组 WA/TA均高于N组(均P＜0.05)，但H3d组较N组增加不明显(P＞0.05)。这说明随着低氧时间的延长，大鼠1周后肺小动脉管壁开始增厚，第4周达较高水平。同时可见Hp组WA/TA明显低于H4w组(P＜0.05)，见表2。这说明 PNS可减轻低氧高二氧化碳大鼠肺小动脉管壁增厚。

表2 慢性低氧高二氧化碳及PNS对大鼠肺细小动脉结构影响的比较Table2.Effect of chronic hypoxia hypercapnia on pulmonary arteriolar remodeling in rats(.n=8)

*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs H3dgroup;▲P＜0.05 vs H1wgroup;☆P＜0.05 vs H2wgroup;★P＜0.05 vs H4w group.

Group WA/TA(%) EA/TA(%)N 28.71 ±2.56 71.39 ±2.56 H3d 30.20 ±2.31 69.80 ±2.31 H1w 35.26 ±2.04＊△ 64.74 ±2.04＊△H2w 44.10 ±2.29＊△▲ 55.90 ±2.29＊△▲H4w 54.98 ±4.21＊△▲☆ 45.02 ±4.21＊△▲☆Hp 46.38 ±1.02＊△▲★ 53.62 ±1.02＊△▲★

3 各组肺组织匀浆磷酸化ERK蛋白表达结果比较

Western blotting结果表明(图2)，肺组织磷酸化ERK表达随低氧高二氧化碳时间延长呈动态变化:在N组未见表达，随低氧高二氧化碳进展，第3 d开始明显升高，灰度值达(0.313±0.042)，2周时达高峰(0.358±0.043)。第4周时磷酸化水平(0.217±0.030)有所下降，但仍高于正常对照组水平(0.018±0.003)，差异显著(P＜0.05)。同时可见 Hp组 p－ERK明显低于 H4w组(P＜0.05)，见表3。

表3 各组肺组织匀浆磷酸化ERK灰度值比较及各组肺小动脉壁磷酸化ERK吸光度值比较Table3.Western blotting analysis of p－ERK expression in lung homogenate(.n=8)，and expression of p－ERK protein in pulmonary arterial walls(.n=10)

*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs H3dgroup;▲P ＜0.05 vs H1wgroup;☆P ＜0.05 vs H2wgroup;★P ＜0.05 vs H4wgroup.

Group p－ERK inp－ERK in lung homogenatepulmonary arterial walls N 0.018 ±0.003 0.107 ±0.016 H3d 0.313 ±0.042* 0.133 ±0.018*H1w 0.339 ±0.053* 0.174 ±0.032＊△H2w 0.358 ±0.043＊△ 0.181 ±0.027＊△H4w 0.217 ±0.030＊△▲☆ 0.185 ±0.021＊△Hp 0.163 ±0.022＊△▲☆★ 0.157 ±0.020＊△☆★

Figure1.Morphological changes in pulmonary arteriole walls(HE staining，×400).A:normal group;B:hypoxic hypercapnia for 3－day group;C:hypoxic hypercapnia for 1－week group;D:hypoxic hypercapnia for 2－week group;E:hypoxic hypercapnia for 4－week group;F:PNS －injected group.图1 光镜下肺细小动脉管壁结构变化

4 各组肺小血管壁磷酸化ERK蛋白表达变化

正常组肺小动脉壁磷酸化ERK表达呈阴性或弱阳性(图3A)，随着低氧高二氧化碳进展，其表达变化主要见于肺小动脉(表3)。且主要表达在肺小动脉中膜(平滑肌细胞)和内膜(内皮细胞)，外膜也有表达(成纤维细胞)。3 d时磷酸化ERK在大鼠肺小动脉壁核表达呈强阳性(图3B)，1周、2周、4周时也有较强活性(图3C、3D、3E)。PNS治疗组磷酸化ERK表达减弱(图3F)。

Figure2.Western blotting analysis of p－ERK expression in lung homogenate.图2 Western blotting检测各组大鼠p－ERK表达

讨论

HHPH中晚期改变以肺血管重建为主，其病理改变为:细胞外基质成分如胶原纤维和弹力纤维的增多，中膜平滑肌细胞肥大和增生，非肌型动脉形成新肌层化，内皮细胞肿胀和肥大，从而导致肺动脉管壁增厚和管腔狭窄[3]甚至消失，引起肺血管阻力增加，导致肺动脉高压甚至右心室衰竭[4]。本实验结果表明，随着低氧高二氧化碳时间的延长和模型复制的进展，大鼠肺动脉平均压和右心指数呈动态增高，2周组和4周组均显著高于正常对照组，光镜下示肺细小动脉内弹力板扭曲，中层平滑肌及外膜胶原纤维增生，管腔狭窄，说明低氧性高二氧化碳肺动脉高压和右心室肥厚模型已建立成功。肺血管重建不但是肺动脉高压持续发展的关键因素，而且是对血管扩张降压药物产生抵抗的主要原因。目前认为，在低氧、高碳酸等各种刺激因子作用下，肺动脉平滑肌细胞增殖以及胶原等细胞外基质在管壁大量沉积是肺动脉重建的最主要的原因。我们的实验发现:(1)随着低氧高二氧化碳时间的延长，大鼠mPAP 1周后即开始明显升高，4周时达到高峰;(2)随着低氧高二氧化碳时间的延长，大鼠2周后RV/LV+S即开始明显升高，4周达最高水平;(3)光镜下可见，N组肺细小动脉内弹力板自然弯曲，平滑肌层未见明显增生，管壁均匀一致，而随着缺氧间期的延长，2周组、4周组内弹力板扭曲明显，中膜平滑肌细胞增生，管腔明显狭窄。说明在低氧高二氧化碳性肺动脉高压形成过程中出现明显的肺血管重建。

Figure3.Expression of p－ERK protein in pulmonary arterial walls(immunohistochemical staining，×400).A:normal group;B:hypoxic hypercapnia for 3－day group;C:hypoxic hypercapnia for 1－week group;D:hypoxic hypercapnia for 2－week group;E:hypoxic hypercapnia for 4－week group;F:PNS －injected group.图3 p－ERK蛋白在肺小动脉管壁内膜、中膜和外膜表达

许多研究[5，6]结果表明，一些促细胞增殖的因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor，FGF)都能直接或间接激活MAPK途径(其中ERK信号途径被认为是经典的MAPK信号转导途径)，参与细胞骨架的形成和细胞迁移的过程，促进血管内皮细胞及平滑肌细胞分裂、增殖。而这些促增殖因子往往都可由低氧激活:研究证实[7]缺氧可上调VEGF的表达水平。ERK信号通路被激活的结果主要是促进血管内皮细胞的增殖[8，9]并通过自分泌和旁分泌作用于肺血管平滑肌细胞(pulmonary vascular smooth muscle cells，PVSMCs)使其增殖。在体外培养的新生鼠心肌细胞上，缺氧/复氧可同时激活 ERK、p38 MAPK 和 JNK 这三类酶[10，11]。Steinbach等[12]研究表明，癌细胞乏氧后会激活MAPK信号转导通路，促进VEGF和EGFR的表达，保护癌细胞避免乏氧诱导的细胞死亡。我们的实验也发现，(1)肺组织磷酸化ERK表达随低氧高二氧化碳时间延长呈动态变化:在N组未见表达，随低氧高二氧化碳进展，第3 d开始明显升高，2周时达高峰，第4周时磷酸化水平有所下降;(2)肺小动脉壁磷酸化ERK蛋白吸光度值变化基本同肺组织匀浆Western blotting结果一致。随着低氧高二氧化碳进展，其主要表达在肺小动脉中膜和内膜，外膜也有少量表达。进一步研究发现，p－ERK蛋白表达变化趋势和肺动脉压力增高、右心肥厚、肺动脉重建的趋势一致(正相关)。这些结果表明低氧高二氧化碳能够引起ERK1/2通路的活化;磷酸化ERK蛋白在HHPH中呈动态变化;它们的活化参与了肺动脉高压的形成以及肺血管的重建，在肺动脉平滑肌细胞、内皮细胞增殖中起重要作用。值得一提的是，p－ERK蛋白在低氧高二氧化碳3d时活性增强，在2周后活性开始下降，说明 ERK1/2通路在低氧高二氧化碳中晚期参与血管重塑的作用减弱。

PNS是目前临床上广泛用于心血管病治疗的药物之一，具有扩张血管、降低血液黏度等多种作用。但目前为止PNS的作用机制还未完全阐明，其与信号转导通路之间的关系研究更是一大盲区。我们的实验采用给肺动脉高压大鼠腹腔注射血塞通注射液(50 mg·kg－1·d－1)，观察 PNS 在肺动脉高压中的作用以及与MAPK通路的关系，连续4周后实验结果显示，PNS用药组大鼠与慢性低氧高二氧化碳性肺动脉高压模型组大鼠相比，平均肺动脉压和右心室重量比都有不同程度的降低，而颈总动脉压无明显改变，提示PNS可抑制或预防慢性低氧高二氧化碳性肺动脉高压的形成而对体循环压无明显影响，即对低氧高二氧化碳性肺动脉高压具有选择性抑制作用。光镜下示肺细小动脉内弹力板扭曲明显减轻，中层平滑肌变薄，管壁面积/管总面积比值(WA/TA)明显降低，管腔面积/管总面积比值(LA/TA)显著升高。提示PNS具有抑制慢性低氧高二氧化碳性肺动脉高压大鼠的肺血管结构重建作用。以往研究表明，PNS可通过增加血浆、肺组织中 NOS活性和NO含量，增加血浆中 T －SOD、Cu/ZnSOD活性，降低红细胞比积和减轻内皮细胞损伤而实现防治慢性低氧性肺动脉高压的形成[13]。周晓霞等[14]研究发现PNS可呈浓度依赖性地抑制VSMCs的增殖并可抑制高脂血清对VSMCs的促增殖作用。提示PNS的抗动脉硬化作用可能是通过抑制VSMC异常增殖实现的。我们的实验表明，Hp组大鼠肺组织及肺动脉壁p－ERK蛋白表达均有下降，同时Hp组肺血管结构重建较4周组显著减轻，说明PNS能够抑制ERK1/2通路活性，从而减轻肺动脉高压的程度。至于PNS下调ERK1/2信号通路激活与肺动脉平滑肌增殖抑制之间的更深层次机制，有待深入研究及探讨。

[1]Nagaoka T，Morio Y，Casanova N，et al.Rho/Rho kinasesignaling mediates increased basal pulmonary vasculartone in chronically hypoxic rats[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，287(4):L665 － L672.

[2]Krens SF，Spaink HP，Snaar－Jagalska BE.Functions of the MAPKs family in vertebrate－development[J].FEBS Lett，2006，580(21):4984 －4990.

[3]Senger DR，Galli SJ，Dvorak AM，et al.Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid[J].Science，1983，219(4587):983 －985.

[4]Marcos E，Fadel E，Sanchez O，et al.Serotonin－induced smooth muscle hyperplasia in various forms of human pulmonary hypertension[J].Circ Res，2004，94(9):1263－1270.

[5]Rousseau S，Houle F，Landry J，et al.p38 MAP kinase activation by vascular endothelial growth factor mediates actin reorganization and cell migration in human endothelial cells[J].Oncogene，1997，15(18):2169 － 2177.

[6]Veikkola T，Karkkainen M，Claessorn－Welsh L，et al.Regulation of angiogenesis via vascular endothelial growth factor receptors[J].Cancer Res，2000，60(2):203 －212.

[7]Zeng H，Dvorak HF，Mukhopadhyay D.Vascular permeability factor(VPF)/vascular endothelial growth factor(VEGF)receptor－1 down－modulates VPF/VEGF receptor－2－mediated endothelial cell proliferation，but not migration，through phosphatidylinositol 3－kinase－dependent pathways[J].J Biol Chem，2001，276(29):26969 － 26979.

[8]Kanno S，Oda N，Abe M，et al.Roles of two VEGF receptors，Flt－ 1 and KDR，in the signal transduction of VEGF effects in human vascular endothelial cells[J].Oncogene，2000，19(17):2138 － 2146.

[9]Meadows KN，Bryant P，Vincent PA，et al.Activated Ras induces a proangiogenic phenotype in primary endothelial cells[J].Oncogene，2004，23(1):192 －200.

[10]Yue TL，Wang C，Gu JL，et al.Inhibition of extracellular signal－regulated kinase enhances ischemia/reoxygenation－induced apoptosis in cultured cardiac myocytes and exaggerates reperfusion injury in isolated perfused heart[J].Circ Res，2000，86(6):692 － 699.

[11]Yin J，Chaufour X，McLachlan C，et al.Apoptosis of vascular smooth muscle cells induced by cholesterol and its oxides in vitro and in vivo[J].Atherosclerosis，2000，148(2):365－374.

[12]Steinbach JP，Klumpp A，Wolburg H，et al.Inhibition of epidermal growth factor receptor signaling protects human malignant glioma cells from hypoxia induced cell death[J].Cancer Res，2004，64(5):1575 －1578.

[13]马文裴，杨映宁，周定邦，等.三七总皂甙对慢性低氧性肺动脉高压大鼠的防治作用[J].中国病理生理杂志，2004，20(6):1074 －1077.

[14]周晓霞，苏佩清，杨鹤梅，等.三七总皂甙对人高脂血清诱发的胎儿血管平滑肌细胞增殖的抑制作用[J].中国动脉硬化杂志，2000，8(1):43－45.