妊娠合并急性胰腺炎大鼠胎盘组织细胞黏附分子E－选择素的表达及意义*

徐丽南，林 楠，张 颖，蔡 坚，王子莲

(1中山大学附属第一医院妇产科，广东 广州 510080;2中山大学附属第三医院肝胆外科，广东 广州 510630)

急性胰腺炎是临床上常见的急腹症之一。在妊娠过程中合并急性胰腺炎发生率在3/10000左右[1]。国外报道其死亡率占妊娠合并急腹症的首位(54.6%)。急性胰腺炎引起的炎症反应可以导致胎盘功能发生一系列改变，其中黏附分子在炎症与胎盘功能改变中起了重要的介导作用。本研究的目的在于探讨细胞黏附分子E－选择素(E－selectin)在妊娠合并急性胰腺炎的作用，通过对血清与胎盘组织中E－selectin表达水平的监测，分析其与胰腺损伤和胎盘功能之间的关系。

材料和方法

1 动物分组

雌性Wistar大鼠60只(购自中山大学实验动物中心)，体重250－300 g;随机分为正常妊娠对照组(10只)、妊娠合并胰腺炎不同时点组(胰腺炎1、4、8、12、24 h 组，每组各为10 只)。

2 方法

2.1 妊娠大鼠模型制备 于发情期将雌、雄大鼠各1只合笼过夜，次晨制作阴道拭子涂片，以显微镜下检出精子之日定为受孕第1 d。

2.2 急性胰腺炎模型的制备 妊娠7 d大鼠实验前12 h开始禁食，自由饮水。戊巴比妥溶液20 mg/kg行腹腔内麻醉。固定，经上腹正中切口入腹，提起十二指肠以小号血管夹分别夹住十二指肠段和肝门部胰胆管。TB针(4.5针头，1 mL注射器)穿刺胰胆管，微泵注射5%牛磺胆酸钠(1 mL/kg)，持续1 min，停留5 min，然后拔除针头，去除血管夹。可观察大鼠胰腺组织明显水肿、出血，缝合腹壁各层。

2.3 取材方法 妊娠合并胰腺炎模型造模成功后1、4、8、12、24 h 将大鼠剖腹，肉眼观察胰腺炎症轻重情况。下腔静脉穿刺取血，室温下凝集30 min，4℃离心10 min，取上清液，－70℃储存用于检测E－selection。

取胰头固定位置胰腺组织，10%甲醛固定，制成石蜡切片，用于HE染色。所有孕鼠均将胎盘娩出后分为2份，1份经Trizol提取RNA后存放入－70℃冰箱用于RT－PCR检测，1份直接放入－70℃冰箱用于蛋白免疫印迹检测。

2.4 血清脂肪酶测定 以全自动生化分析仪采用酶显色法测定大鼠血清脂肪酶。

2.5 血清E－selectin测定 应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定血清 E－selectin(R＆D公司试剂盒)。

2.6 病理学检查 采用盲法，由病理科医生在光镜下观察胎盘改变。胰腺损伤组织学评分:以改良Schmidt等[2]法，并参照 Pozsar等[3]的方法对胰腺损伤进行评分。观察胎盘有无白细胞浸润、微小血栓形成、胎盘绒毛萎缩、合体小结、纤维蛋白沉积、钙化，胎盘梗死，有上述任一改变为1分。正常胎盘(normal placenta)为0－1分;轻度胎盘损伤(mild impairment)为2－3分;中度胎盘损伤(moderate impairment)为4－5分;重度胎盘损伤(severe impairment)为6－7分。

2.7 RT－PCR 法 E －selectin引物根据文献[4]，序列如下:E－selectin(509 bp)，上游引物5’－AAAATGTTCAAGCCTGGCAGTTCC －3’，下游引物5’－GTGGTGATGGGTGTTGCGGTTTCA－3’。β－actin(内参照，389 bp)，上游引物5’－CTTCCTGGGCATGGAGTCCT－3’，下游引物5’－ GGAGCAATGATCTTGATCTTC－3’。取胎盘组织50－100 mg，提取总RNA(R＆D公司试剂盒)，合成cDNA，－20℃保存，进行PCR扩增。反应条件:预变性94℃ 5 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃ 10 min。2%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶0.5 mg/L)电泳检测扩增产物。凝胶图像分析系统扫描各电泳带的灰度值，以UVP凝胶密度扫描仪及其分析软件进行相对表达量分析。

2.8 免疫印迹法 (Western blotting) 取冻存的胎盘组织少量提取蛋白质。采用考马斯亮兰G－250染色法(Bradford法)蛋白质定量。Western blotting采用ImageJ图像分析系统测定蛋白电泳条带的灰度值。在灰度值中0为黑色，255为白色，依据颜色深浅范围为0－255。条带越深值越低，条带越浅值越高。为了更直观地进行比较，将实际测得值用255减去，获得校正值。

3 统计学处理

结 果

1 妊娠合并急性胰腺炎大鼠模型

妊娠7 d大鼠开腹，胰胆管逆行注入5%牛磺胆酸钠后，观察到胰管周围胰腺组织颜色立即变红，并逐渐扩展、加深。于 1 h、4 h、8 h、12 h、24 h 抽血检查血清脂肪酶，均较正常妊娠组明显升高，见表1，造模成功。

2 妊娠合并急性胰腺炎大鼠血清与胎盘组织E－selectin水平的变化

正常妊娠大鼠血清与胎盘组织内E－selectin呈低水平表达。妊娠合并急性胰腺炎模型组，血清与胎盘组织内的E－selectin较正常妊娠组明显升高，其中12 h组与24 h组显著升高，见表1、图1。

表1 妊娠合并急性胰腺炎大鼠血清脂肪酶/E－selectin与胎盘组织E－selectin的变化Table1.The expression of lipase/E－selectin in serum and E－selectin in placenta tissues of pregnant rats with acute pancreatitis(.n=10)

表1 妊娠合并急性胰腺炎大鼠血清脂肪酶/E－selectin与胎盘组织E－selectin的变化Table1.The expression of lipase/E－selectin in serum and E－selectin in placenta tissues of pregnant rats with acute pancreatitis(.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs other groups.

Group Serum lipase(U/L)E－selectinn protein in placenta tissues Control Serum E －selectin(μg/L)E－selectin mRNA in placenta tissues 90 ±23 34.8 ±1.0 0.12 ±0.01 32.20 ±1.25 Acute pancreatitis with pregnancy 1 h 2600 ±128＊＊ 46.6 ±0.9* 0.23 ±0.09* 112.30 ±3.78*4 h 2867 ±189＊＊ 50.4 ±1.2* 0.44 ±0.11* 142.20 ±4.05*8 h 2832 ±109＊＊ 54.7 ±0.9* 0.66 ±0.09* 153.30 ±4.09*12 h 3020 ±220＊＊ 65.8 ±0.8＊＊△△ 0.92 ±0.04＊＊△△ 163.50 ±3.23＊＊△△24 h 2900 ±195＊＊ 61.9 ±1.3＊＊△△ 0.89 ±0.12＊＊△△ 144.10 ±3.68＊＊△△

Figure1.The expression of E－selectin in placenta tissues of pregnant rats with acute pancreatitis.A:RT－PCR，β－actin was used as a control;B:Western blotting，β － actin was used as an internal control.图1 妊娠合并急性胰腺炎大鼠胎盘的E－选择素表达

3 妊娠合并急性胰腺炎大鼠胰腺及胎盘组织的病理学改变与评分

大体观察见胰腺从造模1 h开始至24 h水肿逐渐加重，从1 h开始有炎症细胞浸润，从4 h开始出现点状坏死，12 h出现大片状坏死，大量炎症细胞浸润、部分腺叶正常结构消失，并开始出现肌上皮增生，24 h组织变薄，结构模糊，可见明显增生的肌上皮，从4 h开始可见到个别大鼠有点状出血，见图2。胰腺损伤病理评分:妊娠合并胰腺炎的胰腺损伤病理评分与正常对照组比较有显著差异。

Figure2.HE staining of pancreatic tissues in each group under light microscope(×100).A:control group;B:1 h group;C:4 h group;D:8 h group;E:12 h group;F:24 h group.图2 各组大鼠的胰腺组织HE染色

正常对照组大鼠胎盘组织肉眼及光镜下均未见明显病变。妊娠合并胰腺炎1 h组大鼠胎盘组织可见白细胞浸润;8 h组大鼠胎盘组织损伤加重，微小血栓形成、胎盘绒毛萎缩、纤维蛋白沉积、少量钙化。12 h与24 h组炎性细胞浸润增加，大鼠胎盘组织损伤严重，可见多数钙化，见图3。胰腺及胎盘组织病理评分与胎盘功能分级见表2。

表2 妊娠合并胰腺炎大鼠胰腺及胎盘组织病理评分与胎盘损伤分级Table2.Pancreatic histopathological score，placental pathological score and placental classification of pregnant rats with acute pancreatitis(.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs other groups.

Group Pancreatic histopathological score Placental classification Control Placental pathology score Severe 0.40 ±0.10 Normal Acute pancreatitis with pregnancy 1 h 2.67±0.38* 2.20±0.28* Mild 4 h 2.83±0.48* 2.70±0.56* Mild 8 h 3.83±0.61* 4.20±0.68* Moderate 12 h 5.33±0.49＊＊△△ 6.10±0.28＊＊△△ Severe 24 h 4.50±0.42＊＊△△ 6.30±0.63＊＊△△1

4 相关性分析

采用线性相关分析发现，妊娠合并胰腺炎大鼠血清E－selectin的升高与胰腺损伤程度呈正相关(r=0.908)，与胎盘损伤程度呈正相关(r=0.803)。

讨 论

妊娠合并急性胰腺炎可以造成流产、早产、死产导致围产期婴儿死亡的发生率升高，胎儿的死亡率可高达10% －20%[5]。造成该妊娠不良结局的原因与急性胰腺炎产生的大量炎症因子对胎盘功能的损伤有关。急性胰腺炎引起炎症细胞浸润同时释放大量炎症介质，刺激巨噬细胞释放而引起高细胞因子血症，在黏附分子的介导下，白细胞在器官集聚，随后释放大量的酸性水解酶、弹力蛋白酶及各种氧自由基损害组织造成胎盘功能受损[6]。在这个过程中黏附分子E－选择素(E－selectin)、L－选择素 (L－selectin)、P－选择素(P－selectin)、血管内皮细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule －1，VCAM－1)和细胞间黏附分子 －1(inter－cellular adhesion molecule，ICAM－1)起了重要的介导作用。其中E－selectin是起始黏附作用的关键因子[7]。

在胰腺炎引起的炎症反应中，血循环中的白细胞与内皮细胞的黏附过程是由白细胞表面的黏附分子E－selectin与内皮细胞的同源配体相结合完成的[8]。通过黏附分子共同介导，形成“白细胞－内皮细胞黏附的级联”。一旦白细胞黏附到血管内皮，即可通过一系列机制导致胎盘血管功能障碍及内皮细胞损伤。内皮细胞受TNF－α、IL－1刺激后可合成E－selectin，约1 h后在细胞表面表达，4－8 h达到高峰，可持续24－48 h[9]。由于 E－selectin表达增强，导致大量白细胞与内皮细胞黏附，中性粒细胞，单核细胞和淋巴细胞等黏附到胎盘血管内皮[10]，导致胎盘血管功能障碍和组织损伤，故E－selectin的异常表达增高，标志着血管内皮损伤及功能障碍[11]，提示胎盘功能受到影响。

本研究观察妊娠合并急性胰腺炎动物模型的胎盘组织中E－selectin表达的变化趋势。结果显示，正常大鼠胎盘组织E－selectin呈低水平表达，诱导胰腺炎后1 h，大鼠胎盘组织内E－selectin mRNA表达略有增加，并随时间的推移而增加，在12 h达到高峰。而且在内皮细胞与滋养细胞上均有相同情况出现，这些变化表明大鼠胎盘组织内E－selectin的表达在急性胰腺炎胎盘损伤的早期过程中起关键作用。

本研究结果提示E－selectin的水平表达与妊娠合并胰腺炎大鼠胎盘损伤程度、胰腺损伤程度呈正相关。随着血液与胎盘组织中的E－selectin的浓度增加，胰腺炎的病情加重，妊娠胎盘的损伤也加重，导致最后不良的妊娠结局。同时本研究结果显示，血清的E－selectin的变化趋势与胎盘组织一致。血清E－selectin的升高与胎盘组织损害相关，E－selectin可能参与了妊娠合并急性胰腺炎胎盘损伤的病理生理过程

[1]Gupta K，Wu B.In the clinic.Acute pancreatitis[J].Ann Intern Med，2010，153(9):ITC51 － ITC55.

[2]Schmidt J，Lewandrowsi K，Warshaw AL，et al.Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat[J].Int J Pancreatol，1992，12(1):41－51.

[3]Pozsar J，Berger Z，Simon K，et al.Biphasic effect of prostaglandin E1 on the severity of acute pancreatitis induced by a closed duodenal loop in rats[J].Pancreas，1996，12(2):159 －164.

[4]Sukhotnik I，Greenblatt R，Voskoboinik K，et al.Relationship between time of reperfusion and E－selectin ex-pression，neutrophil recruitment，and germ cell apoptosis after testicular ischemia in a rat model[J].Fertil Steril，2008，90(4 Suppl):1517 －1522.

[5]Tang SJ，Rodriguez－ Frias E，Singh S，et al.Acute pancreatitis during pregnancy[J].Clin Gastroenterol Hepatol，2010，8(1):85 －90.

[6]林旭红，李永渝.急性胰腺炎发病机制及相关治疗的研究进展[J].中国病理生理杂志，2010，26(5):1029－1032，1040.

[7]Lassout O，Pastor CM，Fetaud－Lapierre V，et al.Analysis of the pancreatic low molecular weight proteome in an animal model of acute pancreatitis[J].J Proteome Res，2010，9(9):4535 －4544.

[8]唐诗彬，张肇达，吴路杨，等.急性坏死性胰腺炎大鼠白细胞L－选择素表达和肌动蛋白分布的变化及中药华西胰腺炎一号的影响[J].中国病理生理杂志，2009，25(7):1381 －1385.

[9]Ito S，Osaka M，Higuchi Y，et al.Indoxyl sulfate induces leukocyte－endothelial interactions through up－regulation of E －selectin[J].J Biol Chem，2010，285(50):38869－38875.

[10]Hu Y，Eastabrook G，Tan R，et al.Decidual NK cellderived conditioned medium enhances capillary tube and network organization in an extravillous cytotrophoblast cell line[J].Placenta，2010，31(3):213 －221.

[11]Zawiejska A，Wender－Ozegowska E，Brazert J.Microvascular complications are associated with low levels of maternal sE－selectin and sVCAM－1 in pregnancy complicated with pregestational diabetes mellitus[J].Diabetes Res Clin Pract，2010，88(2):164 －170.