糖尿病兔心肌梗死后钾离子通道蛋白基因表达的变化*

董炳庆，闫素华，王 晔

(1山东大学医学院，山东 济南 250012;2山东省千佛山医院心内科，山东 济南 250014)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是冠心病的独立危险因素，糖尿病并发心肌梗死(myocardial infarction，MI)患者预后差，其室性心律失常与猝死的发生率增高。近年来国内外一系列研究发现，糖尿病的心肌发生了神经重构[1，2]和电重构[3，4]，但糖尿病心肌梗死后是否进一步影响电重构尚未见报道。本研究通过构建糖尿病合并心肌梗死动物模型，运用实时荧光定量PCR的方法，对糖尿病合并心肌梗死后心肌细胞瞬间外向钾离子通道蛋白基因表达的变化特点进行了探讨，以期发现其与室性心律失常的关系，以便指导临床，改善糖尿病合并心肌梗死患者的预后。

材料和方法

1 材料

1.1 动物模型的建立及分组 35只新西兰兔(1.9－2.3 kg)制作糖尿病模型，先用10%猪油、37%蔗糖和53%基础饲料混合制成高脂高糖饲料饲养2个月，之后禁食不禁饮12 h后由耳缘静脉注射四氧嘧啶(alloxan，ALX，80 mg/kg)，并在注射后给予自由饮用5%葡萄糖液24 h以对抗起始阶段的注射后低血糖，后改为一般清洁饮水。以注射后72 h和7 d时2次血糖均≥14 mmol/L作为糖尿病成模标准;如未达标，则按以上方法重复注射ALX(50 mg/kg)1次，成模后改为普通饲料继续单笼喂养4个月。之后成模兔随机分为2组:(1)DM+MI组，以3%戊巴比妥钠腹腔内注射(40 mg/kg)麻醉，开胸暴露心脏，距前降支起始处约1 cm心肌浅层缝扎冠状动脉，逐层关胸，制作心肌梗死模型;(2)DM组，开胸后对应的冠状动脉穿线但不结扎。另外选取14只兔作为对照组，普通饲料同期喂养6个月后制作非糖尿病假手术组模型(开胸后冠状动脉穿线但不结扎)。手术后所有成活兔继续普通饲料喂养2个月后取梗死周围区心肌检测分析。

1.2 仪器和试剂

①主要试剂 Trizol总RNA提取试剂(Invitrogen)，M－MLV逆转录酶(Promega)，0.1%焦碳二乙酯(Sigma)，RT－PCR试剂盒、PCR引物及内参基因引物(上海生工生物科技有限公司)，Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)。

②主要仪器 7300定量PCR仪(Applied Biosystems)，YJ－875A型超净工作台(上海医疗器械二厂)，可调式微量移液器(Gene)，台式高速冷冻离心机(Beckman)。

2 方法

2.1 总RNA的提取 按照Trizol总RNA提取试剂说明书提取样本总RNA。

2.2 cDNA模板的制备 分别取2 μg RNA按照M－MLV逆转录酶说明书反转录成cDNA，并对cDNA原液进行50倍稀释作为实时荧光定量PCR的cDNA工作液，对目的基因进行表达差异分析。

2.3 实时荧光定量PCR 以反转录所得cDNA为模板进行PCR扩增反应，用Primer Premier 5.0软件设计引物(上海生工生物科技有限公司)，具体序列见表1。采用7300定量PCR仪进行荧光定量PCR检测。PCR反应体系(20 μL)包括:cDNA工作液1 μL、正向引物及负向引物(10 μmol/L)各 0.8 μL、高压灭菌去离子水7.4 μL及 Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μL。反应体系如下:50℃ 2 min，93℃ 5 min后进入循环(93℃ 20 s，60℃ 30 s，循环40次，60℃荧光信号采集)。每个反应设3复孔。

表1 实时荧光定量PCR反应引物Table1.Primer sequences for quantitative real－time PCR

2.4 数据分析 实验数据使用 ABI 7000 System Software 1.31分析，将Ct值作为样本表达量标准，采用GAPDH(3－磷酸甘油醛脱氢酶)作为内参照，采用2－ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达水平，即目的基 因 表 达 差 异 = 2－ΔΔCt，ΔΔCt= (Cttarget－CtGAPDH)处理组－(Cttarget－CtGAPDH)对照组。

3 统计学处理

结 果

1 动物一般情况

实验过程中，对照组兔精神状态良好，体重增加明显，反应敏捷，毛色白且有光泽。DM+MI组和DM组兔出现多食、多饮、多尿和消瘦等症状，体重增加迟缓，部分兔出现体重下降，且精神萎靡，皮毛无光泽。实验期间各组兔各阶段空腹血糖变化情况见表2。实验组35只兔制作糖尿病模型过程中，3只未成模，2只因血糖过高死亡，剩余30只随机分为DM+MI组(n=16)和DM组(n=14);制作心肌梗死模型过程中，DM+MI组2只兔死亡，DM组和对照组兔无死亡。最后各组均有14只兔进入统计分析。

表2 实验期间各组空腹血糖的变化Table2.Changes of fasting blood glucose in rabbits(mmol/L..n=14)

表2 实验期间各组空腹血糖的变化Table2.Changes of fasting blood glucose in rabbits(mmol/L..n=14)

*P ＜0.05 vs before ALX and control groups.

Group Before ALX One week later after ALX Experiment ended Control 4.64 ±0.46 4.81 ±0.48 4.88 ±0.55 DM 4.60 ±0.45 19.54 ±3.82*18.46 ±4.47*DM+MI 4.74 ±0.48 18.67 ±3.41*17.44 ±4.03*

2 组间目的基因的比较

目的基因的荧光定量扩增曲线呈现典型的S型，见图1。图2和表3显示，手术后2个月，与对照组相比，DM组和DM+MI组Kv4.3和Kv4.2 mRNA水平明显下降，而 Kv1.4 mRNA明显上升(P＜0.05)。与DM组比较，DM+MI组Kv4.3和Kv4.2 mRNA水平进一步下降(P＜0.05)，但Kv1.4 mRNA上升不明显(P＞0.05)。

Figure1.Amplification curves of target genes.图1 目的基因的PCR扩增曲线

Figure2.Effect of DM and MI on potassium channel mRNA expression in LV myocardium.图2 DM和MI对钾离子通道mRNA表达的影响

表3 目的基因的Ct值Table3.The Ct values of target genes of potassium channel(.n=14)

表3 目的基因的Ct值Table3.The Ct values of target genes of potassium channel(.n=14)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs DM group.

Group Kv4.3 Kv4.2 Kv1.4 Control 4.83 ±0.28 39.81 ±11.76 2.01 ±1.25 DM 4.30 ±0.50* 30.57 ±12.66* 4.80 ±3.13*DM+MI 3.30 ±0.39*#20.60 ±12.99*#7.23 ±5.91*

讨 论

急性心肌梗死是糖尿病患者的严重心血管并发症之一，而急性心肌梗死患者中大约三分之二存在糖代谢异常。糖尿病合并心肌梗死患者预后差，室性心律失常和猝死的发生率明显增加，但其具体机制尚未明确。

前期的动物模型研究[1，2]已初步证实，在梗死的心室肌动作电位时程及QT间期延长，复极和不应期离散度增加，且糖尿病心肌梗死后出现了一定程度的自主神经重构。上述改变均易发生触发活动、折返、异常的自律性进而产生各种室性心律失常。内向电流增加或外向电流减少时动作电位时程延长，因而推测心肌梗死后梗死区内部及梗死周边区尚存活的心肌细胞膜离子通道功能和结构的改变引起心肌电重构，可能是导致梗死后出现心律失常的原因之一。

心室电重构的重要基础是离子通道的重构，细胞膜上的离子通道是形成心肌细胞动作电位的主要来源。瞬间外向钾离子电流是快反应细胞动作电位复极化早期外向电流的主要成分，主要调节静息膜兴奋性，减慢去极化速度，延缓动作电位的产生。刺激交感神经可引起心肌细胞中瞬时外向钾离子电流的改变[5]，Kv4.2、Kv4.3 和 Kv1.4基因是形成瞬间外向钾离子电流的主要基因，前两者是形成快电流的主要基因，后者是形成慢电流的主要基因[6]。以往的大鼠心梗模型研究发现[7]，心肌梗死后Kv4.2和Kv1.4的基因表达呈下降趋势。在本研究中，与对照组比较，不论是DM组还是DM+MI组，Kv4.2和Kv4.3的基因表达均呈下降趋势，而Kv1.4却呈上升趋势。与DM组比较，DM+MI组的Kv4.2和Kv4.3的基因表达进一步下降，而Kv1.4却无明显变化。以上结果表明，不论是糖尿病还是心肌梗死均可导致上述离子通道蛋白基因表达的改变，心肌梗死可能进一步加剧糖尿病对上述基因表达的影响。糖尿病心肌梗死后，上述离子通道发生改变，导致瞬间外向钾离子电流密度下降或电流缺失，导致动作电位平台期延长，复极异常，可以引起复极时程的离散和后除极的发生。另外，梗死区电流密度的大小存在细胞间差异，心室不同部位也存在差异，这种电生理异质性增加了折返激动的易感性，再加上自主神经重构的影响，导致各种心律失常，这也部分解释了糖尿病心肌梗死后心律失常发生率增高的原因。

实时荧光定量PCR时，绝对定量数据容易处理，能给出目的基因的绝对数量，通常在需要确定目的基因绝对拷贝数的条件下使用，但标准品的制备困难，而且不易质控。所以在不需要精确定量的情况下，大都采用相对定量的方法。本研究实时荧光定量PCR时，采用的是目前普遍采用的最简便的基因表达方法即2－ΔΔCt方法，其应用条件是目的基因和内参照基因的扩增效率都接近于1[8]，但在实际反应中，由于引物、RNA模板质量等原因，扩增效率常常达不到1，因而存在一定的误差。因此，在实际应用过程中应优化反应条件，尽量使目的基因和内参基因的扩增效率接近1，以提高检测的准确性。当目的基因表达差异较小时，有条件的话应绘制标准曲线，计算引物的扩增效率，以提高结果的可信度。

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